способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона

Формула изобретения

Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, включающий выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию аллантоисным вирусом болезни Ньюкасл, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора, отличающийся тем, что для индукции используют вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,45 ммк, при этом индукцию и биосинтез проводят одновременно без смены питательной среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к производству человеческого лейкоцитарного интерферона.

В действующем в настоящее время регламенте производства человеческого лейкоцитарного интерферона существует следующая последовательность технологических операций: выделяют лейкоциты из донорской крови, суспендируют их в питательной среде, добавляют к лейкоцитам аллантоисный вирус-индуктор и инкубируют при 37^o C 1-2 часа. Затем лейкоциты отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость, содержащую балластные белки, удаляют, а осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порции среды 199 с необходимыми добавками и инкубируют при 37^o C 18-20 часов. По истечении времени биосинтеза, отделяют среду, содержащую интерферон, от лейкоцитов центрифугированием, осадок с отработанными лейкоцитами отбрасывают (1).

Для индукции интерфероногенеза используют вирус болезни Ньюкасл (ВБН), который выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов. В действующих регламентах к лейкоцитам добавляют вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ) без какой-либо предварительной обработки. ВАЖ, помимо вируса

индуктора, содержит аллантоисные белки, среди которых есть и овальбумин, являющийся сильным аллергеном. Таким образом, вместе с вирусом-индуктором в лейкоциты вносится и овальбумин, присутствие которого в препаратах интерферона ограничено действующей ФС 42-247ВС-91 в пределах 50 нг/мл. Для того, чтобы не превысить указанное значение овальбумина, в регламентах предусмотрено центрифугирование после стадии индукции, в результате которого надосадочную жидкость, содержащую овальбумин и другие аллантоисные белки удаляют, а осадок лейкоцитов ресуспендируют в новой питательной среде. Таким образом, концентрация овальбумина значительно снижается.

Однако центрифугирование в условиях производства интерферона заключает в себе ряд недостатков:

трудоемкость этапа центрифугирования, включающего разлив взвеси лейкоцитов с ВАЖ из биореактора во флаконы перед центрифугированием, отсос надосадочной жидкости из каждого флакона, добавление свежей среды к лейкоцитам и наконец подачу лейкоцитов из флаконов в биореактор. Все эти операции требуют строгого соблюдения правил асептики и антисептики;

при достаточно большом производстве значительный расход стерильного материала и флаконов, что приводит к перегрузке стерилизационного оборудования;

необходимость значительного числа центрифугируют для одновременного центрифугирования лейкоцитарно-вирусной суспензии;

возможность травмирования лейкоцитов в процессе центрифугирования, что может привести к снижению продукции интерферона;

манипуляции, связанные с центрифугированием, значительно увеличивают продолжительность рабочей смены.

Хотя этап центрифугирования и дает значительное снижение концентрации овальбумина, однако в ряде случаев препараты интерферона все же содержат овальбумин в концентрациях выше допустимой. Поэтому в производстве инъекционного препарата интерферона и препарата интерлок для дальнейшего удаления этого аллергена используется иммуносорбция на сорбенте с кроличьими антителами к овальбумину или гельфильтрация на колонках с гелями типа АсА-44. Эти дополнительные манипуляции отличаются большой трудоемкостью, длительностью и многоступенчатостью.

Недавно предложен способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в котором для индукции используют аллантоисный вирус болезни Ньюкасл, концентрированный и очищенный методом ультрафильтрации-диафильтрации в постоянном объеме на мембранах с порогом отсекания по молекулярной массе 100 или 300 кD. Препараты интерферона, полученные с использованием этого вируса, не содержат овальбумин по данным высокочувствительного иммуноферментного метода (2).

Способ осуществляется следующим образом:

1 этап: Удаляют грубые примеси из вируссодержащей аллантоисной жидкости на микрофильтрационных мембранах с диаметром пор 0,5 или 0,8 мМ, заправленных в плоскорамную разделительную установку.

2 этап. Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на ультрафильтрационные мембраны с порогом отсекания 100 или 300 кD, заправленные в плоскокамерную разделительную установку. Вирус концентрируют до желаемого объема, затем проводят очистку в режиме диафильтрации при постоянном объеме вирусного концентрата, используя 15-20 объемов 0,01 М натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,15 М хлористого натрия (рН 7,4-7,6). Фильтрат отбрасывают, а очищенный концентрат проверяют на степень очистки и биологические свойства.

3 этап. Выделенные из донорской крови лейкоциты взвешивают в среде N199. Очищенный вирус-индуктор вводят в среду с лейкоцитами и инкубируют при 37^o C в течении 1-3 ч. Затем лейкоциты отделяют центрифугированием при 1200 g в течение 15 мин. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порции питательной среды. Через 18-20 ч инкубации при 37^o C целевой продукт отделяют от лейкоцитов центрифугированием.

Однако применение для такого высокоочищенного вируса-индуктора не позволяет избежать центрифугирования после стадии индукции интерфероногенеза, так как концентрация овальбумина в противном случае будет превышать допустимую.

В качестве прототипа изобретения выбирается последний способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, так как он является наиболее близким по технической сущности.

Цель изобретения упрощение способа получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Эта цель достигается тем, что для индукции используют вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,45 mМ при этом индукцию и биосинтез интерферона проводят одновременно без смены питательной среды.

Сравнительный анализ существенных признаков изобретения и прототипа свидетельствует, что отличительными признаками заявляемого изобретения являются применение вирусного индуктора, очищенного и концентрированного на мембранах с размером пор 0,1-0,45 mМ. Достигается при этом более высокая степень очистки вируса позволяет исключить из технологии получения лейкоцитарного интерферона наиболее трудоемкий этап этап центрифугирования и вести биосинтез интерферона одновременно с индукцией без смены питательной среды.

Влияние приведенных отличительных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня знаний в области технологии производства вирусиндуцированных препаратов, следовательно, разработанный способ соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ осуществляется следующим образом. Вируссодержащую аллантоисную жидкость выдерживают после отсоса при температуре 4+2^oC не менее одного месяца. Перед очисткой и концентрацией осветляют вируссодержащую аллантоисную жидкость пропуская ее через комплекс фильтрующий погружной П-40М (НТК "Контур" С. Петербург).

Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на микрофильтрационные мембраны, VVPP или GVLP или HVLP (Миллипор, США) с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 mM соответственно, заправленные в плоскопрограммную разделительную установку и концентрируют не менее, чем в 40 раз, затем проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8-10 объемами 0,9% хлористого натрия. Очищенный концентрат проверяют на стерильность, гемагглютинирующую активность. В одном мл концентрата в среднем содержится 10 000 12 000 ГАЕ вируса и 100-200 нг овальбумина (табл.1).

Суспендируют лейкоциты в 199 среде, содержащей необходимые добавки, и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора к лейкоцитам, из расчета 2-4 000 ГАЕ на 1 000 000 000 лейкоцитов, инкубируют взвесь при 37^oC в течение 18-20 ч, постоянно перемешивая. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до рН 2,2-2.4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат интерферона в течение 10 дней для инактивации вируса-индуктора.

Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляет 8-10 000 МЕ в мл, овальбумин отсутствует (табл.2).

Таким образом, предлагаемый способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в отличие от прототипа и существующих в настоящее время регламентов производства человеческого лейкоцитарного интерферона, является предпочтительнее, так как достигает тех же результатов при значительном упрощении способа, сокращении материальных и трудовых затрат, и экономии рабочего времени. Это достигается исключением в предлагаемом способе этапа центрифугирования после стадии индукции и соответственно устранением всех ранее перечисленных недостатков, сопутствующих центрифугированию.