способ обнаружения иммуноглобулина

Формула изобретения

Способ обнаружения иммуноглобулина путем иммунофлюоресцентного окрашивания гистологических срезов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности метода и выявления внеклеточных иммуноглобулинов, производят перфузионную прижизненную фиксацию тканей животного раствором параформальдегида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии, конкретнее к гистологическим методам выявления иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины накапливаются в определенных клетках организма, а также попадают различными способами в межклеточное пространство.

Несмотря на то, что методы визуализации иммуноглобулинов в гистологических препаратах постоянно совершенствуются, с использованием самых разнообразных технологических приемов [1] эффективность иммунофлюоресцентного окрашивания достигнута лишь для иммуноглобулинов внутриклеточной локализации. Более того согласно мнению некоторых исследователей [2] выявление экстрацеллюлярных иммуноглобулинов вообще сомнительно.

Наиболее близким техническим решением, взятым нами за прототип является разработка [3] в которой авторы ввели в протокол исследований стадию трипсинизации, что позволило произвести иммунофлюоресцентное окрашивание гистологических срезов, полученных из фиксированного материала. Однако сами авторы отметили низкую чувствительность метода в отношении внеклеточных отложений иммуноглобулинов.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и выявление внеклеточных отложений иммуноглобулинов.

Указанная цель достигается тем, что прижизненно производят перфузионную фиксацию тканей животного раствором параформальдегида.

Пример 1 (Исследование по способу прототипу).

Крыса линии Вистар (массой 150 гр.) умерщвлена декапитацией. На вскрытии взят кусочек селезенки и помещен в 4% раствор параформальдегида приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,2 7,4, охлажденном до 4 С произведено:

1. Стандартная процедура заливки в парафин;

2. Приготовление срезов толщиною 10 15 мкм. и монтирование их на предметном стекле, покрытом раствором поливинилового спирта.

3. Обработка депарафинированных срезов смесью 0,1% трипсина, 0,1% хлорида кальция pH 7,8 при t 37^oС 1 час;

4. Отмывка в дистиллированной воде, физиологичном фосфатном буфере;

5. Инкубация с раствором антисыворотки против Ig в разведении 1:5 или 1: 10, приготовленном в физиологичном фосфатном буфере с добавление 0,1% бычьего сывороточного альбумина при t 37^oС 1 час;

6. Отмывка в физиологичном фосфатном буфере;

7. Заключение срезов в смесь глицерин-вода 1:1;

8. Просмотр препаратов в люминесцентном микроскопе и фотографирование. На фиг. 1 и 2 видно, что иммуноглобулины визуализируются исключительно внутриклеточно.

Пример 2 (Исследования по заявляемому способу)

Крысе линии Вистар (массой 150 г) под нембуталовым наркозом (доза 40 мг/кг) вскрывали грудную клетку и производили:

1. Перфузию животного через левый желудочек сердца раствором 4% параформальдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,2 7,4 и охлажденного до 4 С (50 мл на 100 г веса). Выделили кусочки селезенки после полного прохождения указанного объема перфузата.

2. Иммерсия выделенного образца ткани в фиксирующем растворе 3-6 часов при t 4^oС.

3. Стандартная процедура заливки в парафин;

4. Приготовление парафиновых срезов толщиной 10-15 мкм. И монтирование их на предметном стекле покрытом раствором поливинилового спирта;

5. Обработка депарафинированных срезов смесью 0,1% трипсина, 0,1% хлорида кальция pH 7,8 при t 37^oС 1 час;

6. Отмывка в дистиллированной воде, физиологичном фосфатном буфере;

7. Инкубация с раствором антисыворотки против Ig в разведении 1:5 или 1: 10, приготовленном на физиологичном фосфатном буфере с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина при t 37^oС 1 час;

8. Отмывка в физиологичном фосфатном буфере.

9. Заключение срезов в смесь глицерин-вода 1:1.

10. Просмотр препаратов в люминесцентном микроскопе и фотографирование (результаты представлены на фиг 3 и 4): видны места локализации иммуноглобулинов как внутриклеточно, так и экстрацеллюлярно, по ходу сосудов.

Контролем в примерах 1 и 2 служили окрашенные срезы: 1) без обработки трипсином; 2) без связывания с антителами против иммуноглобулинов крысы.

Возможность обнаружения внеклеточных иммуноглобулинов была многократно подтверждена в отделе морфологии МЛК Российского государственного медицинского университета и свидетельствует о повышении чувствительности заявляемого метода, по сравнению с прототипом.

Впервые решен ранее дискутировавший вопрос о том, что иммуноглобулины могут локализоваться экстрацеллюлярно и этот факт зафиксирован документально.

Способ может быть широко использован в иммуноморфологических исследованиях на стандартном оборудовании. 2

Использованная литература:

1. Hautser N. W. Wittkuhn J.F. MoCaughey W.T.E. J. Histochem. Cytohem. 1980. v.28.p 52 53.

2. Bursh J. Hamdridge M, Taylor C.L. J.Clin. patol. 1974, 27, N 7, p. 548 557.

3. Huang S. N. Minassian H. More J. D. Lab, Invezt. 1976.v.35, N 4, p. 383-390 прототип.