способ получения вещества, обладающего антигипоксической, седативной, антикоагулирующей, регенерирующей и делипидемической активностью, из термальных вод

Формула изобретения

Способ получения вещества, обладающего антигипоксической, седативной, антикоагулирующей, регенерирующей и делипидимической активностью из термальных вод, включающий фильтрацию азотно-кремневой термальной воды, содержащей альго-бактериальные сообщества, замораживание при 40-50^oС, лиофилизацию под вакуумом при давлении 0,2 10^-3мм. рт. столба в течение 18-24 ч при температуре конденсации 40-45^oС и выстаивание в течение 24-48 ч при температуре 4-6^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к получению биологически активных веществ из природных источников.

Термальные источники Камчатки уникальные природные резервуары лекарственных и биологически активных веществ. Лечебными факторами таких источников являются геотермальные минеральные воды, иловая лечебная грязь, термофильные сине-зеленые водоросли.

Лечебные свойства минеральной воды связаны не только с ее определенным анионным и катионным составом, наличием кремниевой кислоты, азота (азотно-кремнистые термы), но и уникальной микробной флорой - альго-бактериального сообщества. Отдаленность источников делает актуальными попытки создания лечебных экстрактов из сырьевых компонентов источников.

Известен способ получения сухой "раны" из термальных источников, включающий удаление свободной и адсорбционной воды на ротационном испарителе без температурного воздействия. Однако данный способ не позволяет сохранить высокой биологической активности сырьевого компонента источника.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые предложен способ получения биологически активного вещества, обладающего антигипоксическойседативной, антикоагулирующей, и регенерирующей и делипидемической активностью, включающей обработку сырьевых компонентов азотно-кремниевых терм, причем в качестве сырья используют термальную воду, содержащую альго-бактериальные сообщества. Продукт фильтруют, замораживают при температуре -40- -50^oС, лиофилизируют в вакууме при давлении 0,2х10^-3 мм рт.ст. и выстаивают в течение 24-48 часов при температуре 4-6^oС.

Конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. 200 л воды из термального источника пропускают через фильтры Millipor с целью очистки и стерилизации. Разливают жидкость по флаконам и замораживают в течение 5 часов при температуре -40^oС. Далее флаконы помещают в герметичную камеру, подключенную к вакуумному насосу и конденсирующей ловушке. Лиофилизацию осуществляют при давлении 0,2х10^-3 мм рт.ст. в течение 18 часов при температуре конденсации 40^oС. После полной возгонки льда продукт расфасовывают во флаконы и ампулы и выдерживают в течение 24 часов при температуре 4^oС. В результате получают 220 г порошка белого цвета, хорошо растворимого в воде и других растворителях.

В специальных исследованияx проведен сравнительный анализ анионно-катионного состава термальной воды из источника и целевого продукта. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Навеску воды из термального источника пропускают через фильтры Millipor с целью очистки и стерилизации. Разливают жидкость по флаконам и замораживают в течение 18 часов при темперaтуре -50^oС. Далее флаконы помещают в герметичную камеру, подключенную к вакуумному насосу и конденсирующей ловушке. Лиофилизацию осуществляют при давлении 0,2х10 мм рт.ст. в течение 24 часов при температуре конденсации 45^oС. После полной возгонки льда продукт расфасовывают во флаконы и ампулы и выдерживают в течение 48 часов при температуре 6^oC.

Таким образом, из представленной таблицы видно, что использование заявленного способа nозволяет сохранить в целевом продукте оригинальный анионно-катионный состав, присущий нативной воде минерального источника.

Для раскрытия сущности изобретения ниже приведены результаты экспериментальных исследований по изучению биологической активности и безвредности средства, полученного заявленным способом.

1. Исследование токсичности полученного вещества.

1.1. Острая токсичность.

Исследование острой токсичности проведено на белых мышах весом 18-20 г LD₅₀ (доза, при которой при внутрибрюшинном введении погибло 50% животных) составила 2,5 г/кг. Наблюдения за животными осуществляли в течение 240 минут после введения испытуемого вещества, регистрируя состояние каждые 10 минут.

Оценка состояния проводилась по восьмибальной шкале.

Оценка поведенческих реакций в течение всего периода наблюдения показала наличие стандартной двигательной активности. Возбудимость и реактивность в пределах нормы. Ориентировочные рефлексы без изменений.

Тремора, судорог, нарушений походки и изменений тонуса мускулатуры не выявлено. Рефлексы роговичный, зрачковый, частота дыхания и сердечных сокращений в пределах физиологической нормы.

1.2. Хроническая токсичность.

Препарат в дозе 0,05 г/кг вводили животным в течение 21 дня с последующим патологоанатомическим изучением внутренних органов (окраска гематоксилин-эозин и судан-III).

При осмотре органы нормального кровенаполнения. Кровоизлияний в органах не выявлено. Вес печени в пределах нормы. Признаков интоксикации печени, т. е. атрофии, вакуолизации клеток, полиморфизма, пикноза не обнаружили.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о безвредности изучаемого средства в условиях острого и хронического эксперимента.

2. Антигипоксическая активность.

2.1. Исследования на модели гипобарической гипоксии.

Животныx в барокамере со скоростью 50 м/сек поднимали на высоту 12 км. За 30 минут до подъема им в/брюшинно вводили изучаемое вещество в дозах 0,25; 0,05; 0,025 и 0,005 г/кг. На высоте 12 км фиксировали время жизни животных.

Изучаемое средство обладало высокой антигипоксической активностью. Время жизни животных (статистически достоверно р<0,05) повышалось в 5 раз, причем наибольшей активностью обладала доза 0,05 г/кг.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

2.2. Исследования на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

Животных контрольной и опытной групп помещали в сосуд объемом 0,5 л и герметично закрывали. За 30 минут до этого животным опытной группы вводили изучаемый препарат в дозах 0,25 и 0,05 г/кг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в тех же дозах. Эффективность препарата оценивали по времени жизни животных.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Из таблицы видно, что введение препарата вызывает изменение времени жизни животного по сравнению с контролем. Причем эффект более выражен при использовании препарата в дозе 0,25 г/кг.

Представленные данные свидетельствуют о наличии у изучаемого препарата антигипоксической активности. Причем данный эффект проявляется как на модели гипобарической гипоксии, так и гиперкапнической гипоксии.

2. Седативная активность.

Исследования проведены на модели гексеналового сна. Животным (крысы-самцы весом 180-200 грамм) вводили исследуемый препарат однократно или в течение 10 дней в дозах 0,25 и 0,025 г/кг. В контрольной группе вводили физиологический раствор в равном объеме. Через 30 минут после введения изучаемого препарата вводили гексенал в дозе 6О кг/кг и фиксировали время засыпания и время сна. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Как видно из представленной таблицы, однократное введение препарата существенно не влияет на время засыпания и время сна, хотя отмечалась тенденция к укорачению засыпания и увеличению времени сна. После 10-суточного введения исследуемого препарата эти тенденции были статистически достоверно выражены (Р < 0,05).

Таким образом, укорочение времени засыпания и удлинение времени сна позволяет сделать вывод, что исследуемое средство обладает седативным действием.

3. Влияние на факторы свертывания крови.

Определили воздействие изучаемого вещества на свертывание крови у крыс по данным тромбоэластографии при введении за 30 мин до забора крови и в течении 7 суток. Исследованы дозы 0,25 и 0,05 г/кг.

Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из представленной таблицы, достоверные изменения исследуемых показателей отмечаются через 7 дней при введении раствора изучаемого вещества в дозе 0,25 г/кг. Увеличение максимальной амплитуды позволяет сделать вывод, что недельное введение препарата привoдит к статистически достоверному снижению вязкости крови. При этом отмечается укорочение времени начала и окончания свертывания крови. Образовавшийся сгусток, судя по минимальной амплитуде, которая в 8 раз выше, чем в исходном состоянии, довольно рыхлый. В связи с укорочением времени тромбообрaзования и нарушениями процессов формирования сгустка статистически достоверно укорачивается время и до начала его ретракции.

5. Влияние на процессы регенерации.

Исследования проведены на модели линейных резаных ран. Животным (крысы весом 200-220 грамм) под эфирным наркозом наносили рану длиной 5 см, после чего накладывали три шва. В течение 10 дней животным внутрибрюшинно вводили исследуемое вещество в дозе 0,05 г/кг или физиологический раствор в тех же объемах. По окончанию введения и снятия швов на установке, фиксирующей усилия, исследовали эффект заживления путем разрыва ран.

В результате проведенных исследований установлено, что исследуемое вещество статистически достоверно (p< 0,05) в 1,5 раза повышало прочность заживления.

Из представленной таблицы 6 видно, что при 10-дневном введении исследуемого вещества прочность заживления повышается по сравнению с контрольной группой.

Полученные данные свидетельствуют о выраженном ранозаживляющем эффекте средства, полученного заявленным способом.

6. Делипидимическая активность.

В опытной группе животных (белые крысы) осуществляли введение исследуемого вещества в течение 30 суток в дозе 0,25 и 0,05 г/кг ежедневно. В контрольной группе вводили физиологический раствор в тех же количествах. Перед началом опыта животных взвешивали, через 30 суток опыта животных взвешивали повторно. В крови определяли следующие показатели, характеризующие состояния липидного обмена: триглицерид (ммоль/л), альфа-холестерин (ммоль /л) пребета-холестерин (ммоль/л) альфа-холестерин (ммоль/л), по известной методике на биохимическом анализаторе (Spektrym). В последующем раcсчитывали разницу веса тела каждого животнoго до и после курсового введения исследуемого вещества.

В результате проведенных исследований установлено, что при введении исследуемого препарата по сравнению с контрольной группой отмечается статистически достоверное (p.0,05) снижение прироста веса тела. Состояние липидного обмена позволяет предположить, что основная причина этого эффекта связана с выраженным снижением в крови жиров. Результаты этой серии экспериментов представлены в таблицах 7-8.

Из представленной таблицы видно, что введение исследуемого вещества крысам в течение 30 дней вызывает достоверное снижение веса тела животного по сравнению с контрольной группой.

Из представленной таблицы видно, что 30-дневное введение изучаемого вещества вызвало достоверное снижение уровня липидов в крови по сравнению с контрольной группой.

Анализируя оба факта (динамику веса тела и уровень жиров в крови) можно заключить, что исследуемые препараты активируют жировой обмен, а это, в свою очередь, приводит к мобилизации жиров из депо и соответственно к потере веса тела. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7