способ биотестирования токсичности воздушной среды

Формула изобретения

Способ биотестирования токсичности воздушной среды, заключающийся в инкубации водорастворенных токсикантов с биологическим тест-объектом и измерении биолюминесценции последнего, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют лейкоциты крови человека, взятые в состоянии индуцированной зимозаном люминол-зависимой биолюминесценции, а содержание токсикантов оценивают по степени вызванного ими снижения величины максимума биолюминесценции по сравнению с контролем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экологии, в частности, к способам биотестирования токсичности воздушной среды, обусловленной содержанием в ней веществ, обладающих цитотоксическим действием по отношению к клеткам человеческого организма. К числу выявляемых соединений относятся продукты неполного сгорания или окисления органических соединений, токсические газы, летучие органические соединения и др. Способ используется для быстрого интегрального определения поименованных веществ в водных вытяжках загрязненного воздуха химических предприятий, транспортных магистралей, населенных пунктов и т.д. Способ может быть применен для контроля работы систем воздухоочистки, санитарно-гигиенических экспертиз рабочего места, определения безопасности товаров бытовой химии и т.д.

Известны способы биотестирования токсичности водных сред, в том числе из водных вытяжек загрязненного воздуха. Эти способы основаны на использовании в качестве тест-объекта светящихся микроорганизмов или полученных из них люцеферазных ферментных систем, обладающих способностью к биолюминесценции. Под влиянием токсикантов наблюдается полное или частичное ингибирование биолюминесценции перечисленных тест-объектов, что служит мерой токсичности исследуемых веществ. Однако по своим свойствам и восприимчивости к различным токсикантам микроорганизмы существенно отличаются от клеток человека и не могут служить адекватным средством для определения именно тех веществ, которые наиболее токсичны для человека.

Известен способ оценки токсичности компонентов промстоков, основанный на гашении люминесценции светящихся бактерий, являющийся наиболее близким по техническому решению к предлагаемому способу оценки токсичности среды /1/. Известный способ включает инкубацию исследуемого раствора токсикантов с тест-объектом и измерение гашения биолюминесценции последнего под влиянием токсикантов.

Недостатком известного способа является неадекватность получаемой с его помощью информации по отношению к человеку и невозможность перенесения результатов, полученных при работе на микроорганизмах, на чувствительные системы человека иммунную, нервную, кроветворную, наиболее сильно страдающие от токсикантов воздушной среды. Подтверждением этому может служить факт отсутствия у человека люцеферазной ферментной системы, по повреждению которой судят о воздействии токсикантов на микроорганизмы.

Целью предлагаемого изобретения является создание адекватного теста для биотестирования токсикантов воздушной среды применительно к организму человека.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, заключающемся в инкубации образца водорастворенных токсикантов среды с биологическим тест-объектом и измерении биолюминесценции, в соответствии с предлагаемым изобретением в качестве тест-объекта используют лейкоциты крови человека, взятые в состоянии индуцированной зимозаном люминол-зависимой биолюминесценции, а содержание токсикантов оценивают по степени вызванного ими снижения величины максимума биолюминесценции по сравнению с контролем.

Способ осуществляется следующим образом. Водную вытяжку, содержащую водорастворимые токсиканты исследуемой воздушной среды, получают путем барботирования последней через физиологический раствор в стандартных условиях. Суммарный объем пропущенного газа определяют как произведение скорости его пропускания на время.

Лейкоциты периферической крови человека получали следующим образом. К определенному объему свежеполученной донорской крови человека, содержащей 0,35% цитрата натрия, добавляли раствор желатины (конечная концентрация 0,5

1,0%) и выдерживали в течение 15 20 мин. Полученный прозрачный насадок представлял собой взвесь лейкоцитов в концентрации 4-10 x 10⁶ клеток в мл.

Инкубационная среда содержала 50 100 мкл взвеси лейкоцитов в растворе Хенкса, содержащего цитрат натрия, глюкозу (конечная концентрация 1%) и люминол (конечная концентрация 1 х 10^-5M). Биолюминесценцию клеток вызывали добавлением 100 мкл суспензии опсонизированного зимозана (1 мг/мл). Конечный объем пробы 1 мл, температура 37^oC. Контрольная и опытная пробы содержали физиологический раствор или материал исследуемого образца соответственно.

Пробы переносили в кюветодержатель хемилюминометра и измеряли интенсивность биолюминесценции клеток, снимая показания прибора каждый 10 сек. Величину максимума биолюминесценции в контрольной пробе принимали за 100% а интенсивность биолюминесценции в опытных пробах выражали в процентах относительно максимума люминесценции в контрольной пробе. Найденные величины использовали при расчете токсичности исследуемого образца.

За условную единицу токсичности принимали такое количество водорастворенных токсикантов воздушной среды, которое вызывает 50% ингибирование индуцированной биолюминесценции клеток.

При определении токсичности исследуемого образца строят полулогарифмический график зависимости интенсивности биолюминесценции (% от контроля) от логарифма объема внесенного в аналитическую систему раствора токсикантов исследуемой среды. По графику определяют объем раствора токсикантов, вызывающий 50% ингибирование биолюминесценции (см. чертеж).

Примеры конкретного применения.

Пример 1. Табачный дым от сигареты "Опал" (Болгария) объемом 3250 мл пропускали в стандартных условиях через физиологический раствор объемом 5 мл. Для проведения биотестирования токсичности полученного раствора были взяты следующие его объемы: 50, 25, 20, 12,5 и 6,2 мкл. Результаты измерений токсичности различных доз экстракта табачного дыма приведены в таблице 1.

С помощью графика, построенного на основании данных табл. 1, определили, что эффект 50% ингибирования биолюминесценции лейкоцитов оказывают 18 мкл раствора токсикантов табачного дыма, образующихся при сгорании сигареты "Опал", что соответствует 0,9 мл дыма. Следовательно токсичность экстракта табачного дыма, полученного описанным выше способом составляет 55,6 усл. единицы токсичности.

Пример 2. Сравнивали токсичность табачных изделий различного происхождения сигарет "Стюардесса" (Болгария) и "Марлборо"(США), а также отечественных папирос "Беломорканал". В стандартных условиях весь дым, полученный при сгорании всего табачного изделия, пропускали через 5 мл физиологического раствора, а затем определяли токсичность полученного водного экстракта дыма описанным выше способом. Результаты произведенных измерений представлены в таблице 2.

Результаты таблицы позволяют заключить, что по степени токсичности исследованные табачные изделия существенно различаются. Наиболее токсичными следует признать папиросы "Беломорканал", наименее токсичными сигареты с фильтром "Стюардесса".

Определение токсичности этих табачных изделий, выполненные с использованием взвесей лейкоцитов, полученных из крови различных доноров, дали идентичные результаты. Это свидетельствует об устойчивости предлагаемого способа, характеризующегося помимо этого еще и достаточно высокой воспроизводимостью (коэффициент вариации составил 4 5%).