способ определения содержания этанола в биологическом материале

Формула изобретения

Способ определения содержания этанола в биологическом материале, включающий инкубацию исследуемого образца в среде, содержащей ферментную оксидазно-пероксидазную систему и индикаторное вещество с последующей регистрацией уровня продукта реакции, отличающийся тем, что в качестве образца используют водную вытяжку выдыхаемого воздуха, в качестве индикаторного вещества люминол в трис-HCl буфере, pН 8,2, а уровень продукта реакции оценивают по величине светосуммы хемилюминисценции.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к аналитической и медицинской химии, к способам определения этанола в выдыхаемом воздухе, биологических жидкостях и пищевых продуктах. По скорости выполнения анализа способ может быть квалифицирован как экспрессный, по чувствительности как высокочувствительный. Способ может иметь значения при выполнении судебно-медицинских экспертиз, при контроле состояния шофера перед выходом на линию, при контроле содержания алкоголя при спиртовом брожении и т. д. Быстрота выполнения экспертизы, количественный характер оценки и минимальные требования к лабораторной базе делают предлагаемый способ перспективным для широкого использования в медицине и пищевой промышленности.

Известны способы определения этанола в выдыхаемом воздухе, биологических жидкостях и пищевых продуктах, основанные на использовании ферментных систем

алкоголь-оксидазной и алкоголь-дегидрогеназной /1-2/. Ферментативное окисление этанола, содержащегося в исследуемом материале, приводит к окислению или восстановлению различных индикаторных веществ красителей или коферментов, регистрируемому колориметрическим или иным способом /1-6/.

Известен способ колориметрического определения этанола, наиболее близкий предлагаемому изобретению по решению технической задачи и основанный на использовании оксидазно-пероксидазной системы, где роль индикаторного вещества выполняет 4-аминофеназон, окисление которого регистрируют при длине волны 600 нм /5/. По сравнению с алкоголь дегидрогеназными системами, оксидно-пероксидазная система характеризуется рядом методических преимуществ - более высокой чувствительностью, простотой экспериментального выполнения и т.д.

Недостатком известного колориметрического способа является то, что при определенных условиях (невысокое содержание этанола в образце, высокое содержание примесей, мешающих определению и т. д.) его реальная чувствительность (1х10^-6 г в пробе) оказывается недостаточной для точного определения спирта. Помимо этого процедура определения этанола известным способом достаточно длительна (30 мин), чтобы использовать способ в качестве экспресс-теста.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и сокращение времени проведения анализа.

Поставленная цель достигается изменением состава реакционной среды и переходом к хемилюминометрическому способу регистрации продуктов реакции с использованием в качестве индикаторного вещества люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фтализиндиона). В состав реакционной смеси включены следующие компоненты: алкоголь-оксидаза, пероксидаза и люминол, растворенные в трис-HCI буфере, pH 8,2.

Как следует из калибровочного графика (рис. 1), чувствительность определения этанола предложенным хемилюминометрическим способом составляет 2х10^-10 г в пробе. Это позволяет разбавлять исследуемые образцы в 10² 10⁵ раз и тем самым сводить к минимуму влияние примесей, мешающих определению. Время окисления спирта и, следовательно, протекания реакции в выбранных условиях составляет 60 сек. Коэффициент вариации не превышает 5%

Способ осуществляется следующим образом. В стеклянную цилиндрическую кювету вносят 0,5 мл реакционной смеси, содержащей алкоголь-оксидазу (1 ед. активности), пероксидазу (50 мкг препарата с RZ 3,0) и люминол в конечной концентрации 5х10^-5 М, растворенные в 0,05 М трис-HCI буфере, pH 8,2. Кювету переносят в термостатируемый при 25^oC кюветодержатель люминометра, и реакцию окисления инициируют добавлением 100 мкл исследуемого образца. Определив светосумму фотохимической реакции, с помощью калибровочного графика находят содержание этанола в 100 мкл образца, взятого на анализ.

Пример конкретного применения: определение динамики содержания этанола в выдыхаемом воздухе испытуемого, выпившего 25 мл 40% этилового спирта. Исследовали содержание этанола в пробах, полученных путем барбатирования выдыхаемого испытуемым воздуха (0,5 л) в стандартных условиях через дистиллированную воду, налитую в стеклянный сосуд, содержащий 10 мл жидкости. Полученную таким образом водную вытяжку разбавляли в 50 раз дистиллированной водой и брали 0,1 мл на определение этанола вышеописанным способом. Результаты определения этанола в выдыхаемом воздухе в динамике приведены в таблице 1.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что предлагаемый способ пригоден для контроля содержания алкоголя и выдыхаемом воздухе даже в случае приема испытуемым минимальных доз алкоголя. Наиболее достоверно определяется этанол через 1 час после потребления спиртных напитков. Это соответствует ранее определенной динамике метаболизма этанола в организме человека.

Технико-экономическая эффективность способа. Предлагаемое изобретение (способ определения содержания этанола в биоматериале) характеризуется высокой чувствительностью, простотой методического воплощения и экспрессностью. Его применение позволит более чем в 1000 раз увеличить чувствительность определения этанола и в 30 раз ускорить анализ по сравнению с традиционно применяемыми колориметрическими ферментными методиками. Это обеспечивает возможность широкого применения способа в судебно-медицинской экспертизе алкоголизма, в работе наркологических диспансеров, а также в пищевой промышленности (производство низкоалкогольных напитков и винно-водочных изделий). В наркологических службах ГАИ способ сможет придти на смену полуколичественным тестам, дающим качественную оценку состояния алкогольного опьянения водителей, или сложным и долгим методам газоаналитических исследований содержания этанола. В винно-водочной промышленности предлагаемый способ может быть использован в мониторинге процессов сбраживания сырья.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения в медицине и пищевой промышленности может существенно повысить качество экспериментальных оценок и значительно ускорить и удешевить анализы.