способ определения активности аденозинтрифосфотиз поверхностной клеточной мембраны клеток эукариот

Формула изобретения

Способ определения активности аденозинтрифосфатаз поверхностной клеточной мембраны клеток эукариот, включающий выделение иммунокомпетентных клеток, разведение их физиологическим раствором, проведение реакции гидролиза добавленного специфического субстрата АТФ-Na, остановку реакции добавлением кислоты, определение образовавшегося неорганического фосфата, отличающийся тем, что выделенные иммунокомпетентные клетки разводят физиологическим раствором до концентрации 1l0⁶ клеток /мл, а реакцию гидролиза проводят сразу после разведения клеток физиологическим раствором с последующим определением образовавшегося неорганического фосфата непосредственно в пробе, где проходила реакция гидролиза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области диагностики, а именно к определению активности аденозинтрифосфатаз (АТФаз) поверхностной клеточной мембраны иммунокомпетентных клеток. Возможно использование в иммунологии и медицине для оценки функционального состояния системы иммунитета по характеристикам активности ферментов иммунокомпетентных клеток.

Известен биохимический способ определения активности АТФаз поверхностной клеточной мембраны, использованный в целом ряде работ (1, 2, 3).

Этот способ (1), взятый нами за прототип, включает 8 стадий.

1. Выделение иммунокомпетентных клеток либо из органов иммунной системы (селезенка, тимус, костный мозг, лимфоузлы), либо из периферической крови или лимфы доноров, либо из культур клеток и т.п.

2. Отмывание клеток в физиологическом растворе, подсчет их количества под микроскопом в камере Горяева и разведение их до концентрации не менее 10⁷ кл/мл.

3. Разрушение клеток любым доступным методом (гомогенизация в 0,25 М растворе сахарозы, трехкратное замораживание-оттаивание, ультразвуковая дезынтеграция и пр.

4. Получение супернатанта, содержащего фрагменты поверхностной клеточной мембраны путем центрифугирования клеточного гомогената при 1000g 10 мин.

5. Инкубация разного количества полученного супернатанта при 37 град. в среде следующего состава: 100 мМ NаСl, 15 мM КСl, 6 мM MgСl, 3 мM АТФ-Nа в 30 мM трис-НСl буфере рН 7,4. Время инкубации от 30 до 60 мин.

6. Остановка ферментативной реакции гидролиза добавлением в инкубационную среду либо ТХУ, либо перхлорной кислоты.

7. Удаление денатурированного белка центрифугированием и перенос прозрачного супернатанта в чистые сухие пробирки.

8. Определение количества неорганического фосфата (Фн) в отобранном супернатанте любым доступным методом и выражение активности АТФаз через количество Фн, высвобождаемого 1 х 10⁶ клетками (либо 1 мг белка микросомальной фракции) за определенное время инкубации с коррекцией на содержание эндогенного Фн в клетках и на неферментативный гидролиз АТФ-Nа.

Метод позволил показать, что величина ферментативной активности АТФаз поверхностной клеточной мембраны иммунокомпетентных клеток связана с их способностью реагировать на митогены, образовывать розетки с эритроцитами барана, выполнять целый ряд специфических функций. Этим же методом было показано, что АТФазная активность лимфоцитов периферической крови больных раком легких значительно выше таковой здоровых доноров и больных с неонкологическими легочными заболеваниями. Иными словами, оценка активности ферментов поверхностной клеточной мембраны, являющейся первым местом контакта иммунокомпетентных клеток между собой и с различными внешними агентами, может характеризовать функциональную полноценность клетки.

Однако для широкого использования как в научных исследованиях, так и для разработки биохимического теста оценки функциональной полноценности иммунокомпетентных клеток по активности ферментов поверхностной клеточной мембраны описанный метод не подходит в силу ряда своих недостатков.

Существенным недостатком является его неточность в определении поверхностной АТФазной активности клеток, т.к. в используемом в ферментативной реакции супернатанте из разрушенных клеток содержатся, помимо фрагментов поверхностной клеточной мембраны, еще и митохондрии и их фрагменты,имеющие свою митохондриальную систему АТФаз. Поэтому речь можно вести не о поверхностной, а только об общей активности АТФаз клетки. Более того, супернатант содержит широкий спектр ферментов цитоплазмы, которые могут вызывать не связанное с гидролизом АТФ-Nа изменение количества определяемого Фн в ходе реакции. Кроме того, часто происходит экранирование изучаемых количественных изменений уровня Фн из-за высокого исходного уровня свободного эндогенного Фн самой клетки.

К недостаткам метода можно отнести и использование различных способов разрушения клеток, что не позволяет сравнивать полученные разными исследователям результаты, другими словами, не позволяет стандартизировать метод.

Ощутимым недостатком метода является его низкая чувствительность, т.е. необходимость использования довольно больших количеств исходного материала. Этот недостаток способа особенно негативно сказывается при оценке АТФазной активности клеток крови человека. Так, для выполнения исследования необходимо 10-15 мл крови при условии нормального содержания в ней клеточных элементов. При использовании крови больных людей, у которых количество клеток часто бывает значительно снижено, для выполнения исследования необходимо уже 20-30 мл. Кроме травматичности, такой подход не всегда осуществим, особенно у ослабленных больных, а у детей просто невозможен.

Целью изобретения является повышение точности и чувствительности метода, его упрощение, возможность стандартизации и уменьшение количества клеток для анализа.

Поставленная цель достигается тем, что реакцию гидролиза ведут с неразрушенными клетками, количество которых в среде инкубации составляет 1 х 10⁵-5 х 10⁵ против 2 х 10⁶-6 х 10⁶ по прототипу, а уровень образовавшегося при гидролизе неорганического фосфата определяют непосредственно в объеме реакционной смеси.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Иммунокомпетентные клетки, выделенные из крови, селезенки, тимуса, лимфоузлов, костного мозга, из культуры клеток, отмывают 2 раза раствором следующего состава: NаСl 100 мМ, KСl 20 мМ, трис-НСl 30 мМ, рН 7,4, именуемым далее средой инкубации (СИ) без Мg, и 2 раза тем же раствором, но содержащим 5 мМ Мg, именуемым далее СИ с Мg. Отмытые клетки ресуспендируют в СИ с Mg, определяют их количество в камере Горяева под микроскопом, жизнеспособность по окраске трипановой синью и разводят в среде инкубации с Мg до концентрации 1 х 10⁶ кл/мл.

Реакцию гидролиза проводят в 0,5 мл СИ с Mg, содержащей 2 мМ АТФ-Nа и 1 х 10⁵ 3 х 10⁵ клеток, рН 7,4 в течение 60 мин при 37 град. По истечении указанного времени реакцию гидролиза останавливают добавлением 0,25 мл 15% ТХУ и определяют количество образовавшегося неорганического фосфата (Фн) в каждой пробе (3). Активность АТФаз поверхностной клеточной мембраны выражают в количестве мкм Фн, высвобождаемого 1 х 10⁶ клетками за 60 мин инкубации с коррекцией на содержание эндогенного неорганического фосфата в клетках и на неферментативный гидролиз АТФ-Nа.

В приведенных ниже примерах представлены результаты определения активности АТФаз поверхностной клеточной мембраны иммунокомпетентных клеток по предлагаемому способу и по прототипу. Эксперименты проводились параллельно в один день на одной исходной суспензии клеток. В качестве объекта исследования были взяты клетки селезенки линейных мышей, т.к. только в этом случае можно было получить достаточное количество клеток для проведения сравнительных экспериментов.

Пример 1 (предлагаемый способ).

1. 3 мышей линии СЗН/А забивали, вскрывали брюшную полость и извлекали селезенки, которые гомогенизировали в 10 мл физиологического раствора в слабо притертом гомогенизаторе. Полученные клетки селезенки фильтровали через капроновую сетку для удаления обрывков соединительной ткани и наслаивали на раствор фиколл-верографин плотностью 1,077-1,078 (1 объем фиколла: 3 объема суспензии клеток). После центрифугирования при 400g 30 мин отбирали мононуклеарные клетки, находившиеся над слоем фиколл-верографин в виде белого кольца. Клетки отмывали 2 раза раствором следующего состава: NаСl 100 мM, КСl 20 мM трис-HCl 30 мM рН 7,4, именуемого далее средой инкубации (СИ) без Мg, и два раза тем же раствором, но содержащим 5 мМ Мg, именуемым далее СИ с Мg.

2. Отмытые клетки ресуспендируют в СИ с Mg до концентрации 1 х 10⁶/мл, именуемой далее рабочей суспензией клеток.

3. В три опытные пробирки вносят по 0,1 мл 2 мМ АТФ-Nа в СИ с Мg, рН 7,4, затем добавляли в 1-ую пробирку 0,1 мл рабочей суспензии клеток, во вторую 0,2 мл рабочей суспензии клеток и в 3-ю 0,3 мл рабочей суспензии клеток и затем объем в каждой пробирке доводили до 0,5 мл при помощи СИ с Mg. В три контрольные пробирки вносили только раствор АТФ-Nа по 0,1 мл и раствор СИ с Мg по 0,3, 0,2 и 0,1 мл соответственно. Опытные и контрольные пробирки закрывали пробками, встряхивали и инкубировали 60 мин в термостате при 37 град. По истечении указанного времени во все пробирки добавляли 0,25 мл 15% ТХУ для остановки реакции гидролиза. В контрольные пробирки после раствора ТХУ вносили по 0,1, 0,2 и 0,3 мл рабочей суспензии клеток соответственно. Содержимое опытных и контрольных пробирок перемешивали, добавляли в каждую по 3 мл 0,1% раствора молибдата аммония в 0,1N Н₂SO₄ и спектрофотометрировали при 320 нм против соответствующего контроля.

4. Количество неорганического фосфата определяли по калибровочному графику, где по оси X отложены концентрации Фн, а по оси Y величина ОС при 320 нм. Активность фермента выражали в количестве мкм Фн, высвобождаемого 10⁶ клетками за 60 мин инкубации.

Измеренная активность АТФаз неразрушенных клеток селезенки составила 15019 мкм Фн на 10⁶ клеток за 60 мин инкубации.

Пример 2 (прототип).

1. 3 мышей линии СЗМ/А забивали, вскрывали брюшную полость и извлекали селезенки, которые гомогенизировали в 10 мл физиологического раствора в слабо притертом гомогенизаторе. Полученные клетки селезенки фильтровали через капроновую сетку для удаления обрывков соединительной ткани и наслаивали на раствор фиколл-верографин плотностью 1,077-1,078 (1 объем фиколла 3 объема суспензии клеток). После центрифугирования при 400g 30 мин отбирали мононуклеарные клетки, находившиеся над слоем фиколл-верографин в виде белого кольца. Клетки отмывали 2 раза раствором следующего состава: NаСl 100 мM, КСl 20 мM, трис-НСl 30 мM рН 7,4, именуемого далее средой инкубации (СИ) без Mg, и два раза тем же раствором, но содержащем 5мM Mg, именуемым далее СИ с Мg.

2. Отмытые клетки ресуспендировали в среде инкубации с Мg, определяли их количество в камере Горяева под микроскопом и разводили в СИ с Мg до концентрации 5 х10⁶ клеток/мл, 10 х 10⁶ клеток/мл и 20 х 10⁶ клеток/мл соответственно в трех разных пробирках.

3. Из каждой пробирки с разной концентрацией клеток отбирали по 3 мл клеточной суспензии, переносили в новые пробирки и клетки разрушали трехкратным замораживанием-оттаиванием. Полученные клеточные гомогенаты центрифугировали 1000 об/мин 10 мин и отбирали супернатанты, которые далее использовали для проведения ферментативной реакции.

4. В каждом супернатанте (от равных концентраций клеток) оценивали активность АТФаз по следующей схеме: в 3 опытные пробирки вносили по 0,1 мл 2 мМ АТФ-Nа в СИ с Мg, рН 7,4, затем добавляли в 1-ую пробирку 0,1 мл супернатанта, во вторую 0,2 мл супернатанта и в 3-ю 0,3 мл супернатанта и затем объем в каждой пробирке доводили до 0,5 мл при помощи СИ с Мg. В 3 контрольные пробирки вносили только раствор АТФ-Nа по 0,1 мл и раствор СИ с Мg по 0,3, 0,2 и 0,1мл соответственно. Опытные и контрольные пробирки закрывали пробками, встряхивали и инкубировали 60 мин в термостате при 37 град. По истечении указанного времени во все пробирки добавляли 0,25 мл 15% ТХУ для остановки реакции гидролиза и осаждения белка. В контрольные пробирки после раствора ТХУ вносили по 0,1, 0,2 и 0,3 мл супернатанта соответственно. Содержимое всех пробирок тщательно перемешивали и пробирки центрифугировали 2000 g 10 мин. Из каждой пробирки отбирали по 0,5 мл супернатанта, переносили в новые сухие пробирки, добавляли 3 мл 0,1% раствора молибдата аммония в 0,1N Н₂SO₄, и спектрофотометрировали при 320 нм против соответствующего контроля.

5. Количество неорганического фосфата определяли по калибровочному графику, где по оси X отложены концентрации Фн, а по оси Y величина OD при 320 нм. Активность фермента выражали в количестве мкм Фн, высвобождаемого 10⁶ клетками за 60 мин инкубации.

Было проведено 10 экспериментов на клетках селезенки мышей, разрушенных трехкратным замораживанием-оттаиванием. Измеренная активность АТФаз клеток селезенки, разрушенных трехкратным замораживанием-оттаиванием, составила 6,3 + 1,08 мкм Фн на 10⁶ клеток за 60 мин инкубации.

Пример 3 (прототип).

1. 3-х мышей линии СЗН/А забивали, вскрывали брюшную полость и извлекали селезенки, которые гомогенизировали в 10 мл физиологического раствора в слабо притертом гомогенизаторе. Полученные клетки селезенки фильтровали через капроновую сетку для удаления обрывков соединительной ткани и наслаивали на раствор фиколл-верографин плотностью 1,077-1,078 (1 объем фиколла 3 объема суспензии клеток). После центрифугирования при 400 g 30 мин отбирали мононуклеарные клетки, находившиеся над слоем фиколл-верографин в виде белого кольца. Клетки отмывали 2 раза раствором следующего состава: NаСl 100 мм, КСl 20 мМ, трис-НСl 30 мМ рН 7,4, именуемого далее средой инкубации (СИ) без Мg, и два раза тем же раствором, но содержащим 5 мM Мg, именуемым далее СИ с Мg.

2. Отмытые клетки селезенки ресуспендируют в СИ с Мg, содержащей 0,25 М сахарозы до концентрации 5 х 10⁶ клеток/мл, 10 х 10⁶ клеток/мл и 20 х 10⁶ клеток/мл соответственно в трех разных пробирках.

3. Из каждой пробирки с равной концентрацией клеток отбирали по 5 мл клеточной суспензии,переносили в хорошо притертый стеклянный гомогенизатор и клетки разрушали гомогенизированием. Полученные клеточные гомогенаты центрифугировали 1000 об/мин 10 мин и отбирали супернатанты, которые дальше использовали для проведения ферментативной реакции.

4. В каждом супернатанте (от разных концентраций клеток) оценивали активность АТФаз по следующей схеме: в 3 опытные пробирки вносили по 0,1 мл 2 мМ АТФ-Nа в СИ с Мg, рН 7,4, затем добавляли в 1-ую пробирку 0,1 мл супернатанта, во вторую 0,2 мл супернатанта и в 3-ю 0,3 мл супернатанта и затем объем в каждой пробирке доводили до 0,5 мл при помощи СИ с Мg. В 3 контрольные пробирки вносили только раствор АТФ-Nа по 0,1 мл и раствор СИ с Мg по 0,3, 0,2 и 0,1 мл соответственно. Опытные и контрольные пробирки закрывали пробками, встряхивали и инкубировали 60 мин в термостате при 37^oС. По истечении указанного времени во все пробирки добавляли 0,25 мл 15% ТХУ для остановки реакции гидролиза и осаждения белка. В контрольные пробирки после раствора ТХУ вносили по 0,1, 0,2 и 0,3 мл супернатанта соответственно. Содержимое всех пробирок тщательно перемешивали и пробирки центрифугировали 2000 g 10 мин. Из каждой пробирки отбирали по 0,5 мл супернатанта, переносили в новые сухие пробирки, добавляли 3 мл 0,1% раствора молибдата аммония в 0,1% NH₂SO₄ и спектрофотометрировали при 320 нм против соответствующего контроля.

4. Количество неорганического фосфата определяли по калибровочному графику, где по оси X отложены концентрации Фн, а по оси Y- величина ОD при 320 нм. Активность фермента выражали в количестве мкм Фн, высвобождаемого 10⁶ клетками за 60 мин инкубации.

Измеренная активность АТФаз клеток селезенки, разрушенных гомогенизацией в 0,25 М сахарозе, составила 9,71,3 мкм Фн на 10⁶ клеток за 60 мин инкубации.

Сравнение величин активности АТФаз поверхностной клеточной мембраны, измеренных по прототипу (примеры 2, 3) и по предлагаемому способу (пример 1) выявляет их существенные различия. Поскольку активность АТФаз поверхностной клеточной мембраны разрушенных и неразрушенных клеток определяли параллельно, в один день, используя одну общую исходную суспензию клеток, можно утверждать, что выявленные различия связаны с тем, что при нарушении структурной целостности поверхностной клеточной мембраны активность встроенных в нее ферментов снижается, это подтверждается тем, что АТФазная активность поверхностной клеточной мембраны клеток селе/венки, разрушенных замораживанием-оттаиванием, ниже таковой, разрушенных гомогенизацией в 0,25 М растворе сахарозы.

Из данных таблицы 1 видно, что если работать по предлагаемому способу, то удается заметить увеличение количества Фн, образующегося при гидролизе АТФ-Nа целыми клетками уже при содержании последних 1 х 10⁶ в 0,5 мл инкубационной смеси (колонка 3, таблица 1) и увеличение количества Фн пропорционально количеству клеток (до выхода на плато калибровочной прямой) (колонка 5, таблица 1). Если же работать по прототипу, то увеличение количества Фн, образующегося при гидролизе АТФ-Nа микросомальной фракцией, выделенной центрифугированием из разрушенных клеток, удается зафиксировать только в том случае, если количество микросомальной фракции в 0,5 мл инкубационной смеси соответствует не менее чем 3 х 10⁶ клеток (колонка 7, таблица 1). Тогда становится понятным необходимость использования в прототипе большего количества клеток 10⁷ мл по сравнению с 10⁶ мл в предлагаемом способе.

Таким образом, первым преимуществом предлагаемого способа перед прототипом является повышение чувствительности метода в 10-100 раз.

Вторым преимуществом, вытекающим из первого, является существенное уменьшение количества материала, необходимого для выполнения исследования. Это очень важное преимущество, т.к. позволяет снизить количество необходимой для исследования крови с 20 мл (прототип) до 2 мл (предлагаемый способ), что особенно важно для ослабленных больных и детей.

Третьим преимуществом предлагаемого способа перед прототипом является повышение точности, вытекающее из того, что при использовании неразрушенных клеток можно с полным правом говорить об активности АТФаз именно поверхностной клеточной мембраны в отличие от прототипа, где используется микросомальная фракция, содержащая помимо фрагментов поверхностной клеточной мембраны еще и митохондрии с их фрагментами, имеющие свою митохондриальную систему АТФаз.

Четвертым преимуществом предлагаемого способа является его упрощение зa счет исключения этапов центрифугирования гомогената и отбора надосадка, центрифугирования реакционной смеси и отбора надосадка из схемы определения активности АТФаз.

Пятым преимуществом, вытекающим из предыдущего, является существенное уменьшение времени, необходимого для оценки АТФазной активности (4 часа по предлагаемому способу против 7 часов по прототипу).

Кроме того, предлагаемый метод дает возможность стандартизации, т.к. исключается влияние способов разрушения клеток на величину измеряемой активности АТФаз поверхностной клеточной мембраны.

Источники информации.

1. J. Ellegaard s N. Dimitrov, 1972, ATPase activity of lym phocytes from normal individuals and patients with cancer", Cacer, v.30, n.4, 881-884.

2. K. Kraglalle J. Ellegaard, 1977, "Increased ATPase activity of lympocytes after rosette formation with sheep red blood cells "Scand. J.Haematol, v.18, 369-376.

3. D. N. Baron, F.A. Khan, 1985, "Optimal conditions for measurement of ATPase acivity of human leucocytes", Clin Sci, v.68, n.68, n.2, 143-149.