способ определения содержания гемоглобина в эритроцитах и устройство для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ определения содержания гемоглобина (Нв) в эритроцитах, предусматривающий измерение гематокритного числа (НеF) и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) в пробе цельной крови, расчет Нв НеFМСНС, отличающийся тем, что гематокритное число определяют, втягивая пробу крови в капиллярную трубку, снабженную поплавковым элементом, выполненным из материала, плавающего на слое красных кровяных телец, затем капиллярную трубку центрифугируют обычно на протяжении 5 мин при 10000g и определяют гематокрит с учетом объема поплавкового элемента как отношение между длиной столбца крови в капиллярной трубке и длиной слоя уплотненных эритроцитов, далее измеряют глубину погружения поплавкового элемента в слой эритроцитов, а также длину части поплавкового элемента, находящейся в слое плазмы, при этом плотность эритроцитов (Дг) в пробе определяют по формуле

(Дг Дf)Lг + (Дp Дf)Lp О,

где

Дг плотность красных кровяных телец;

Дf плотность поплавкового элемента;

Дp плотность плазмы;

Lr длина поплавкового элемента, погруженного в красные кровяные тельца;

Lp длина поплавкового элемента, находящегося в слое плазмы, после чего определяют среднее содержание гемоглобина в эритроцитах пробы согласно формуле:

МСНС (Дг + Ks) + Kо,

где

Ks тангенс угла наклона кривой линейной корреляции зависимости плотности эритроцитов от уровня средней концентрации гемоглобина в эритроцитах;

Ko точка пересечения этой кривой с осью У, причем кривая получена в результате исследования статистически значимого количества пробы крови с применением поплавкового элемента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что корректируют вычисление концентрации гемоглобина по эффекту потери веса по закону Архимеда у поплавка на светлом слое кровяного образца.

3. Устройство для измерения концентрации гемоглобина, красных клеток крови в пробе цельной антикоагелированной крови, содержащее прозрачную капиллярную трубку с пробкой в донной части и поплавок, расположенный в трубке, причем длина поплавка превышает его ширину, отличающееся тем, что боковая поверхность поплавка имеет рифления, а площадь его поперечного сечения не превышает 2/3 от площади поперечного сечения трубки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к простой методике для измерения концентрации гемоглобина в образце цельной крови, более конкретно к методике, которая может быть быстро осуществлена относительно неквалифицированным персоналом.

На цельной крови обычно осуществляют два измерения гематокрита и гемоглобина. Гематокрит представляет собой процентный объем, который занимают уплотненные красные клетки крови в центрифугированном образце цельной крови, а содержание гемоглобина это вес гемоглобина, приходящегося на единичный объем цельной крови. Численное отношение гемоглобина к гематокриту считается средней корпускулярной концентрацией гемоглобина (MCНC), причем для нормальных индивидуумов эта величина близка к 33,9% Однако, когда индивидуум страдает определенными заболеваниями, тогда это может изменяться приблизительно от 38 до 26% Таким образом, определение гематокрита, а также гемоглобина является важным для обнаружения и диагноза анемии или других нарушений крови.

В больших лабораториях измерения гематокрита и гемоглобина обычно проводятся одновременно в автоматизированном анализаторе, однако в небольшой клинике или в кабинете врача они должны проводится раздельно, с использованием двух различных методик. В настоящее время гаматокрит может быть измерен путем заполнения небольшой полой стеклянной трубки антикоагулированной цельной кровью, запаиванием одного конца трубки и центрифугирования пробирки с целью уплотнения красных клеток крови. После уплотнения, на которое требуется приблизительно от трех до пяти минут в небольшой центрифуге, измеряются длина слоя уплотненных красных клеток крови и общая длина заполнения, причем рассчитывается гематокрит, выраженный в виде процента.

Следует признать, что для приготовления пробирки или проведения измерений требуется небольшая квалификация. В патенте США N 4.027.660, выданном 7 июня 1977 С.К.Уардлоу и др. N 4.156.570, выданном в мае 1978 С.И.Уардлоу; и N 4.558.947, выданном 17 декабря 1985 г. С.К.Уардлоу и др. описана методика, которая включает втягивание пробы антикоагулированной цельной крови в капиллярную трубку, размещение поплавка в трубке с пробой крови и центрифугирование пробы крови, что приводит к осаждению поплавка в слой красных клеток, удлиняющего поглощающее покрытие в пробе крови. Эта методика уровня техники также может быть использовала для измерения гематокрита, только принимая в расчет расширение части пробы крови под действием поплавка при расчете общей длины компонентов крови, причем наблюдаемая общая длина сопоставляется измерительным инструментом, чтобы компенсировать наличие поплавка.

С другой стороны, измерение концентрации гемоглобина значительно сложнее. Для проведения этого анализа в небольшой клинике или кабинете врача пробу крови необходимо более точно развести в соотношении или 1:250 или 1: 500, в зависимости от применяемого оборудования. Это разведение проводится путем точного отбора очень маленькой пробы крови в пипетку и перенесения ее в емкость, содержащую агент, который растворяет красные клетки крови, и цианид, который превращает гемоглобин в легче измеряемое вещество. Затем эту смесь, после выдерживания в течение 3-10 минут, помещают в фотометр, в котором сопоставляется ослабление зеленого света при 560 нм с таковым для стандартных раствором. Из этих сопоставлений можно рассчитать концентрацию гемоглобина. Имеется много опубликованных вариаций этого метода, однако во всех имеющихся на сегодняшний день способах требуется точное измерение ослабления света в предназначенном для этой цели приборе. Кроме того, необходимость точного манипулирования с малыми количествами пробы требует повышенного уровня персонала, чем для измерения гематокрита, и поэтому также является источником аналитических ошибок.

Мы изобрели методику для измерения гемоглобина в пробе крови, в которой используются в основном те же самые принадлежности и инструменты, которые в настоящее время используются при измерения гематокрита. Наша методика основана на том, что мы обнаружили обратно пропорциональную зависимость между концентрацией гемоглобина в уплотненных красных клетках крови и глубиной погружения поплавка, известного из уровня техники, в слой красных клеток. Микропроцессор в измеряющем приборе может быть запрограммирован таким образом, чтобы переводить дополнительные измерения глубины в концентрацию гемоглобина. Для осуществления методики этого изобретения используются следующие стадии способа. Пробу цельной крови затягивают в трубку для центрифугирования, предпочтительно капиллярную трубку, антикоагулируют и в трубку устанавливают поплавок. После затыкания дна трубки пробу подвергают центрифугированию с тем, чтобы расслаивать кровь на красные клетки, поглощающие покрытие и плазменный слой. В ходе центрефугирования поплавок устанавливается в слое красных клеток. Затем мажет измеряться гематокрит, в основном так же, как и в уровне техники.

Гемоглобин измеряется следующим образом. Как указано выше, МСНС красных клеток крови представляет собой концентрацию в них гемоглобина, обычно около 340 г/л. Следовательно, приблизительно 1/3 каждой клетки составляет гемоглобин, а остальное приходится на воду и небольшое количество солей и второстепенных белков относительно постоянной концентрации. Отсюда следует, что фактически единственный вклад в различие плотностей между красными кровяными клетками различных пациентов обусловлен концентрацией в них гемоглобина. Поэтому плотность уплотненных красных клеток крови пропорциональная МСНС, причем если эта величина (МСНС) может быть определена точно, то содержание гемоглобина может быть рассчитано так:

Гемоглобин Гематокрит х MCНC

Аппаратура этого изобретения включает прозрачную трубку постоянного внутреннего диаметра, в которую помещается резиновый поплавок. Антикоагулированную кровь засасывают в эту трубку или под действием капиллярных сил, или за счет небольшого всасывания. Точное количество не важно, поскольку имеется достаточно крови, чтобы поддерживать поплавок на поверхности. Один конец трубки затыкают, и затем трубку подвергают центрифугированию с ускорением приблизительно 10 000g в течение пяти минут. Это тот же самый режим, который в настоящее время применяется для проведения стандартного определения гематокрита. Когда завершается центрифугирование, поплавок, который имеет удельный вес между удельным весом плазмы и уплотненных красных клеток крови, будет частично поддерживаться этими уплотненными красными клетками крови. Гематокрит измеряется путем определения отношения между длиной образца крови в трубке (общая длина уплотненных красных клеток крови, поглощающего покрытия и плазмы) и одной длиной слоя уплотненных красных клеток крови. Разумеется, при осуществлении этого расчета следует учитывать объем поплавка. Поскольку глубина погружения поплавка обратно пропорциональна плотности уплотненных красных клеток крови, плотность красных клеток крови может быть рассчитана и переведена в содержание гемоглобина следующим образом.

Сумма подъемных сил, действующих на плавающий предмет, находящийся в равновесии, такой как применяемый в этом изобретении поплавок, равна нулю. Подъемные силы в трехфазной системе, такой как наша, содержащая цилиндрический пластмассовый поплавок, уплотненные красные клетки крови и плазму, могут быть выражены следующим образом:

(Д_г Д_f) x L_г + (Д_р Д_f) x L_р 0.

где Д_г это плотность уплотненных красных клеток крови, Д_f- плотность пластмассового поплавка, L_г длина поплавка, которая погружена в уплотненные красные клетки крови, Д_р- плотность плазмы и L_р длина поплавка, которая погружена в плазму.

В приведенном выше уравнении плотность уплотненных красных клеток крови неизвестна. Плотность и длина пластмассового поплавка известна и вводится в память микропроцессора. Аналогично известна плотность плазмы и она вводится в память микропроцессора. Длина поплавка, которая погружена в красные клетки крови, измеряется и таким образом вводится в микропроцессора. Наконец, длина поплавка, которая погружена в плазму, вычисляется микропроцессором путем вычитания длины поплавка, погруженной в слой красных клеток крови, из общей длины поплавка. Таким образом микропроцессор может разрешить это уравнение относительно плотности красных клеток крови (Д_г).

После того как определена Д_г, может быть рассчитана величина МСНС с помощью микропроцессора, путем решения следующего уравнения:

МСНС (Д_г x K_s) + K_o

Константы МСНС, K_o и K_s могут быть определены эмпирически, путем проведения измерений плотности красных клеток крови для ряда разнообразных образцов и корреляции плотности с MCНC, которая определена с помощью традиционных стандартных измерений. Константа угла наклада (К_s) и константа отрезка (K_о) наиболее пригодна для корреляционного уравнения, используется затем для расчета MCHC по данным плотности красных клеток крови. После расчета величины К_s и K_o не будут изменяться, если не изменяются критические параметры принадлежностей, то есть плотность поплавка и т.д.

Из величины МСНС может быть определена концентрация гемоглобина, как описано ранее, т.е. Гемоглобин Гематокрит х МСНС.

Поэтому целью этого изобретения является предоставление усовершенствованной методики для измерения содержания гемоглобина в пробе цельной крови.

Дополнительная цель этого изобретения заключается в предоставлении методики описанного типа, в которой содержание гемоглобина измеряется как функция степени погружения поплавка в уплотненный слой красных клеток крови центрифугированного образца крови, содержащегося в трубке.

Дальнейшей целью этого изобретения является предоставление методики описанного типа, в которой измерения гемоглобина и гематокрита могут быть проведены легко и быстро с использованием или без использования автоматического расчетного устройства.

Изобретение иллюстрируется чертежами, на которых изображено: на фиг. 1 - вертикальный вид стеклянной трубки, содержащей центрифугированный образец крови и поплавок, который уравновешивается в слое красных клеток крови центрифугированной пробы крови, на фиг.2 поперечный разрез трубки по линии 2-2 на фиг.1.

Обращаясь к чертежам, трубка 2 является предпочтительно стеклянной капиллярной трубкой, которая может иметь антикоагулянт, нанесенный на внутренние стенки. Нижняя часть трубки 2 закрывается глинистой пробкой 4 или пластиковой крышкой, которая защелкивается на конце трубки 2, после того как проба крови введена в трубку 2. Поплавок 6 размещается в трубке 2, и когда араба крови подвергается центрифугированию в трубке 2, поплавок 6 уравновешивается в слое красных клеток, который обозначается цифрой 8. Выше поплавка 6 находится слой плазмы 10. Поплавок 6 имеет заранее известную осевую длину L, причем специалист, проводящий измерения, измеряет расстояние L_г, которое является длиной поплавка 6, которая погружена в слой красных клеток. Показанный на чертежах поплавок имеет конфигурацию с выемками в поперечном сечении. Эта конфигурация обеспечивает меньшую площадь поперечного сечения поплавка 6, так что наблюдаемая осевая длина центрифугированного образца крови, и особенно поглощающего покрытия, не будет значительно удлиняться. Выемки 7 на поплавке 6 служат для поддержания соосного расположения с трубкой 2. Как отмечалось ранее, поплавок с выемками с пониженным поперечным сечением не является существенным для осуществления измерений гематокрита и гемоглобина. В этом варианте воплощения площадь поперечного сечения поплавка предпочтительно не должна превышать приблизительно 2/3 от поперечного сечения внутри трубки.

Используемая для определения кровь должна быть антикоагулированной, с тем чтобы красные клетки крови и плазма могли разделиться. Это может быть осуществлено втягиванием крови внутрь сосуда, содержащего антикоагулянт, до загрузки крови в трубку, или путем введения антикоагулянта, такого как гепарин и ему подобные, внутрь самой непосредственно из прокола в пальце.

Можно признать, что эта методика занимает не больше времени и не требует большей квалификации, чем измерение одного гематокрита. Также можно признать, что оптический прибор со сканированием, такой как описано в патенте США N 4.156.570, выданном в мае 1978 С.К.Уардлоу, или в патенте США N 4.558.947, выданном 17 декабря 1985 С.К.Уардлоу (оба специально введены в описание путем ссылки во всей полноте) может использоваться для считывания длин и автоматического расчета результатов. Поскольку эта методика опирается на два первичных измерения (длины и плотности) испытание не требует стандартизации.

Существуют два основных варианта воплощения принадлежностей, которые используются при осуществлении методики изобретения. Первый такой, как показано на чертежах, описанных выше, и второй идентичен устройству, описанному в патенте США N 4077396, выданном 7 марта 1978 С.К.Уардлоу и др. (описание которого специально приведено здесь путем ссылки во весь полноте), в котором применяется поплавок, расширяющий поглощающее покрытие. В последнем случае необходимо принимать в расчет подъемные силы расширенных слоев поглощающего покрытия, однако показания могут быть рассчитаны с помощью микропроцессора, в который предварительно вводится программа, изложенная в последующем.

Когда поплавок является достаточно большим, чтобы осуществить измерения поглощающего покрытия, как описано в упомянутых выше патентах США, выданных Уардлоу и сотрудникам, подъемная сила, которая воздействует на поплавок со стороны расширенного поглощающего покрытия, может компенсироваться следующим образом. Когда используется такой поплавок, три клеточных компонента поглощающего покрытия слагаются с подъемными силами, воздействующими на пластиковый поплавок и поэтому должны учитывается при расчете плотности красных клеток крови. Следовательно, будет использоваться следующее уравнение

(Д_г-Д_f)xL_г+(Д_g-Д_f)xL_g + Д_1м-Д_f)xL_1м+(Д_р1-Д_f) x L_р1+(Д_р-Д_s)xL_р в котором Д_р, Д_г, Д_f, L_р, L_г и L_f такие, как указано выше,

L_р1 наблюдаемая длина подлавка, расположенная в слое тромбоцитов образца крови:

L_м1 наблюдаемая длина поплавка, расположенная в моноцит/ лимфоцитном клеточном слое образца крови;

L_g наблюдаемая длина подлавка, расположенная в гранулоцитном клеточном слое образца крови;

Д_g плотность гранулоцитного клеточного слоя;

Д_1м плотность лимфоцитно/моноцитного клеточного слоя, и Д_р1 - плотность тромбоцитного слоя.

Прибор, который используется, приспосабливается для измерения числа компонентов белых клеток, как описано в вышеупомянутом уровне техники. Таким образом, в микропроцессор вводится информация, которая описана выше, а также вводится значения плотностей гранулоцитов, лимфоцит/моноцитов и тромбоцитов. В ходе измерительной методики измеряются длины поплавка, находящиеся в гранулоцитном, лимфоцитно/моноцитном и тромбоцитном слоях и таким образом вводятся в микропроцессор. Значение L_f может раcсчитываться микропроцессором как разность между общей длиной поплавка минус сумма длин поплавка, погруженных в слои красных клеток, гранулоцитов, лимфоцит/моноцитов и тромбоцитов. Затем может быть рассчитана величина Д_г с помощью микропроцессора. Когда расчитана Д_г, значение концентрации гемоглобина определяется, как изложено в первом примере. Эта методика была проверена при определении гемоглобина и гематокрита у 100 пациентов. Полученные результаты с помощью изобретения практически были идентичны таковым, полученным в больничной лаборатории с использованием автоматизированных анализаторов (относительная стандартная ошибка равна 2,7%).

Можно легко признать, что методика этого изобретения позволит легко и быстро осуществлять измерения гематокрита и гемоглобина в антикоагулированных образцах цельной крови. Эта методика может проводиться относительно неквалифицированным персоналом и она может осуществляться на одной пробе крови. Эта методика особенно приспособлена для использования в небольших клиниках и кабинетах врачей, но также может применяться в более крупных лабораториях в больницах.

Поскольку могут быть осуществлены многие изменения и вариации в описанных вариантах воплощения изобретения, без отклонения от замысла изобретения, не следует ограничивать это изобретение иначе, чем это истребовано в прилагаемых пунктах формулы.