композиция для лечения состояний, чувствительных или восприимчивых к воздействию ложноспаренной ds рнк

Формула изобретения

1. Композиция для лечения состояний, чувствительных или восприимчивых к воздействию ложноспаренной ds РНК, содержащая последнее и поверхностно-активное вещество, отличающаяся тем, что содержит топический носитель, а поверхностно-активное вещество является бифункциональным анионным, катионнным или неионным, в котором один конец молекулы поверхностно-активного вещества является полярным и смешивающимся с водой, а другой конец молекулы неполярным и ложноспаренная ds РНК является комплексом полинозината и подицитидилата, содержащим от 1 до 5-30 урациловых или гуанадиновых оснований при следующем содержании компонентов, мас.

Носитель 70-99,004

Ложноспаренная ds РНК 0,001-10,0

Поверхностно-активное вещество 0,005-20,0.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что ложноспаренная ds РНК содержит участки разрыва связи и имеет формулу rInr(C_11-14V)n, где n -целое число от 4 до 29.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно: к фармацевтическим составам для локальной аппликации, содержащим ложноспаренные двутяжевые рибонуклеиновые кислоты (дт РНК) и биологически активные фрагменты смешанных дт РНК, стабилизированные детергентна и в виде тройного комплекса. Составы стабильны при хранении и остаются локально активными в качестве активируемых и других факторов.

Неионные детергенты (поверхностно-активные вещества) обладают доказанной спермицидной активностью и являются активными составляющими различных свободно продающихся (нерецептурных) противозачаточных кремов и пен. В высоких концентрациях детергенты проявляют явно токсическое воздействие на клетки, которые ограничивают их потенциальную пригодность; такие концентрации необходимы для эффективности против вируса герпеса, поскольку они вызывают распад вирусной оболочки. Имеются сообщения, что детергенты иннактивируют некоторые линии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), по крайне мере in vitro.

Другой класс макромолекул, активных против вирусов, рака и воспалительных клеток in vivo, это дт РНК, которые, будучи относительно нетоксичными, биологически нестабильны при температуре тела 37^oС, что может ограничивать их полезность и простоту обращения с ними. В жидком виде некоторые дт РНК должны, например, бережно храниться при 4^oС для предотвращения их молекулярного разрушения. По этим причинам дт РНК применяют путем впрыскивания в поток крови пациента. Обнаружено, что путем приготовления смесей из детергентов и дт РНК в физиологически приемлемых носителях можно достигнуть множества неожиданных свойств. Эти новые свойства включают: а) стабилизацию дтРНК против связанного с температурой ферментативного разрушения, б) синергическая биологическая активность, которая существенно расширяет антимикробный спектр смешанного продукта по сравнению с любым из компонентов и в) облегченное проникновение в локально доступные клетки, приводящее к более высокой внутриклеточной концентрации биоактивного материала, благодаря облегченному трансмембранному переносу тройных и четверных комплексов, построенных вокруг отрицательно заряженной сердцевидной молекулы дтРНК, Наиболее важно, что объединенные продукты демонстрируют необычайно высокую специфическую биоактивность против ВИЧ и других передающихся половым путем патогенов, включая членов семейства вирусов герпеса. Т.о. предлагается новая серия тройных комплексов (2 цепи комплементарно ложноспаренной РНК плюс детергент, образующий мицеллу вокруг дтРНК), которые имеют новые биофизические и биологические свойства.

Сами по себе или вместе с комплементарными лимфокинами и/или ингибиторами обратной транскриптазы эти продукты сообщают хозяину повышенную защищенность во входных воротах проникновения различных патогенов. Эта и другие характеристики изобретения более детально изложены ниже.

Использованные поверхностно-активные вещества могут быть анионными, катионными или неионными по природе. Обычно эффективность применения таких агентов при местном применении относили к их способности растворять различные липидсодержащие мембраны, что может давать им способность действовать в качестве спермицидов и растворять структуры нуклеокапсида вируса герпеса 1 и 2 (см. патент США N 4, 507, 281 Asculai et al. и патенты, питированные в нем, которые здесь включены в виде ссылок).

Было обнаружено, что неионные детергенты применимы в качестве спермицидов в вагинальных контрацептивах и один неионный детергент, обозначенный аоноксинод- 9 /NP9/, получил широкое применение в противозачаточных кремах и пенах.

Однако при применении таких детергентов необходимо соблюдать осторожность, поскольку они могут вызвать токсичность в нормальных клетках (Asculai et al, Antimicrob, Agents and Chemo. том 13, с. 686, 1978). R app и другие наблюдали синергический эффект человеческого альфаинтерферона (белок) с нококсинолом-9 в отношении специфического подавления HS тип 2 (Rapp et al. Antimicrob, Agents and Chemo, том 28, стр.449,1985; Lancet, т м 2, дек. 21/28, стр. 1442, 1985), описали инактивацию in vitro НТLV-Ш (ВИЧ, то же, что и вирус ВИЧ) концентрациями ноноксинола- 9, использованного без добавок, которые были 0,05% или выше Hicks наблюдал токсическое воздействие ионоксинола-9 на нормальные лимфоциты, которые становилось явным при концентрациях более чем 1% Поскольку концентрации ноноксинола-9 в коммерчески доступных спермицидах составляют 1-5 (Noeller Lancet, том 1, стр. 1153 май 17, 1986), нонокоидол-9 может хорошо поражать нормальные мочеполовые клетки, в то же время потенциально атакуя "свободный" ВИЧ или ВИЧ внутри лимфоцитов, В связи с тем, что разработка вакцины против СПИДа может состояться через несколько лет (Fanci, Proc. Natl. Acad. Sci, USA т. 83, стр. 9278 1986), различные шаги для борьбы с распространением должны быть осуществлены быстро. Как выделяет Fanci наиболее спорный вопрос заключается в том, на ком проверять вариант вакцины, если будет доказано, что вариант безопасен и эффективен даже в случае гомосексуалистов мужчин. исследования будут сложными. Это подчеркивает важность немедленной разработки некоторых временных методов для уменьшения риска переноса вирусов и других микроорганизмов, в процессе половых отношений для предотвращения их дальнейшего распространения на основную популяцию. Например, Fanci оценивает, что "верхушка айсберга" может составлять только в США 150 000 случаев "ВИЧ".

Местные соединения для обработки вирусных состояний описаны в патентной литературе. Составы для обработки герпесных (лихорадочных) инфекций, содержащие человеческий интерферон, антивирусный неионный поверхностно-активный агент (нонилфекокоиполиэ оксиэтанол) и носитель, описаны в патенте США 4 507 281 Asculai и других. Полинуклеотиды, индуцирующие интерферон, такие как дтРНК полирибоинозиновая кислота: полирибоцитидиловая кислота или поли 1-С, описаны в патенте США N 4 283 393 Field и др. котором индуктор интерферона (поли 1-С) гомогенко смешан о водорастворимым полимером в качестве нормированно высвобождающейся местной аппликации для обработки инфицированных вирусов тканей почки, глаза и слизистой оболочки, восприимчивых и обработке интерфероном. Levy в патенте США N 4, 024,241 описывает устойчивые к нуклеазам гидрофобные комплексы поли 1-С с поли-L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой. Простые смеси поли 1-С в водных растворах, мазях, кремах или жидких препаратах описаны в патенте США 4.124.702 Lampson и др.

Токсичность поли I-С отмечена в литературе (Adamson, Nature, т. 223, август 16, 1969) и по этой причине от терапевтического использования поли I-С в основном отказались. Наоборот, смешанные дтРНК, использованные в фармацевтических составах настоящего изобретения, относительно низкотоксичны или нетоксичны. Продукты деградации (фрагменты) спаренных дтРНК, которые неизбежно появятся при длительном хранении, остаются существенное время биоактивными и в некоторых отношениях более активны, чем исходный компонент.

В завершение отметим, что существует по крайней мере два различных обозначения вируса ВИЧ; LAV-обозначение вируса ВИЧ, изолированного в Пастеровском институте, Париж, Франция, и НТrV III обозначение вируса ВИЧ, выделенного в Национальном Институт Здоровья, Бетезда, Мэрилэнд, США. В этом тексте часто будут ссылки на вирус вообще или обозначенный ВИЧ, или НТrV-III, или LAV без намерения различать их.

Термин "ВИЧ" в спецификации и формуле изобретения включает все другие вирусы, которые могут быть ассоциированы с возникновением ВИЧ инфекции у человека, включая серопозитивных бессимптомных носителей, СПИД связанный комплекс или ССК и синдром приобретенного иммунодефицита, или СПИд, уже изолированный или нет.

В Европейском патенте, опубликованном как 0213921, 11 марта 1987. озаглавленном модуляция вирус связанных событий двутяжевой РНК, описывается подавление ВИЧ в культуре человеческих клеток дтРНК, специфически используя Ampligen в качестве прототипа дтРНК. Катионные поверхностно-активные вещества являются предпочтительными детергентами, однако могут быть использованы не-ионные или анионные детергенты. Удобные анионные детергенты включают алкилсульфонаты и алкилбензенсульфонаты натрия. Подходящие катионные детергенты включают детергенты с четвертично-аммониевой группой, включая цетилпарадиумхлорид и хлориды бензалкония. В противоположность катионным и анионным детергентам неионные не содержат ионизующихся групп и не имеют молекулярного заряда. Они в общем зависят от поверхностной активности всей их молекулы в целом.

Однако практически все гидрофобные соединения, которые имеют в своей структуре карбокси, гидрокси, амидные или аминогруппы со свободным водородом, присоединенном в азоту, могут быть введены в реакцию с этиленоксидом для образования неионного детергента.

Здесь описывается новый тройной комплекс ложноспаренных комплексов дтРНК с детергентами; дт РНК также имеют гидрофобные черты, вызывающие образование основаниями нуклетидов в двух комплементарных целях компактной двуспиральной структуры. В изобретении образуется тройной комплекс, т.е. цепь РНК-1" плюс комплементарная цепь РНК-2" плюс детергент для получения тройного ( или трехчленного) комплекса с совершенно новыми биофизическими и терапевтически важными биологическими свойствами.

Относительная концентрация детергента (катионного в данном случае) определяет относительную полярность результирующего комплекса, которую можно варьировать для различных терапевтических целей. Обеспечивая избыток детергента, когда тройной комплекс уже сформирован, можно привести к преципитации комплекса, которая может придать желательные свойства для некоторых местных применений.

Ключ к настоящему изобретению построение мицеллы на или вокруг дтРНК с нейтральным, анионным или катионным детергентом с целью получения нового терапевтического свойства высокой (локализованной) активностью биологической. Мицелла определяется как структура, образованная добавлением молекул с молекулярными группами бифункциональности к другому водному (совместимому с водой) субстрату, такому как дтРНК. Бифункциональность относится к молекуле, у которой один конец полярный, т.е. растворимый воде, которая полярна, и другой конец неполярный, т.е. имеющий большее сродство к липидам как основному компоненту клеточных мембран. Желательно построение такого тройного комплекса, которое приводит к мицелле, он более терапевтически активен благодаря двум или более свойствам, которые позволяют ему ( результирующему комплексу) намного легче проходить сквозь клеточную мембрану клеток мишеней (раковых клеток, инфицированных вирусом клеток, иммунных клеток и т.д.).

Свойство 1: черта ключевая для облегчения трансмембранного переноса это результирующий желательный поверхностный заряд тройного (мицеллярного) комплекса по сравнению с некомплексированной (бинарной) дтРНК и повышенная гидрофобность, которая облегчает подход к клеточной мембране, физическое слияние с ней и ускоренное проникновение внутрь.

Свойство 2: природа частиц тройных комплексов, описанная ниже, включая мицеллярные комплексы, но не ограничиваясь ими, еще более облегчает попадание внутрь клетки, обусловливая дополнительное свойство клеточного фагоцитоза, который без образования мицелл происходит в минимальной степени.

Фагоцитоз это процесс, в котором углубления в клетке (называемые пиноцитозными вакуолями и т.п.) физически поглощают частицы дтРНК в тройных или четверных комплексах, ускоряя их перенос во внутриклеточный (в противоположность внеклеточному) компартмент, что является необходимой ступенью достижения максимальной биоактивности в человеке. Этот процесс агоцитоза также может происходить с биофрагментированными дтРНК, например ложноспаренными дтРНК.

Молярная доля (относительная концентрация) детергента определяет относительную полярность результирующего комплекса, которая может варьироваться для различных терапевтических целей. Обеспечивая избыток детергента после образования третичного комплекса, можно получить преципитацию комплекса, что может привести к желаемым свойствам для некоторых местных применений.

Частный случай, иллюстрирующий полезность данного изобретения, это тройной комплекс, образованный между катионным детергентом, таким как цетитриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и дтРНК. Из-за основной природы своих полярных остатков он ориентируется по отношению к дтРНК так, что дтРНК образует отрицательно заряженную сердцевину, вокруг которой расположен положительно заряженный детергент. Любой основной (катионный) детергент может заместить ЦТАБ и дать мицеллу, которая будет намного более стабилизирована и биоактивна, чем помещение дтРНК внутрь простой липидной структуры (например, липосомы), которая держится только благодаря намного более слабым гидрофобным связям. В результате в результирующей мицелле полярная природа детергента уменьшает отрицательно заряженную поверхность дтРНК, так что теперь больший неполярный тройной комплекс легче переносится через клеточную мембрану. Далее специфичность попадания мицеллы внутрь можно увеличить, обеспечивая уже дополнительную специфичность для клеток мишеней, например, построением четвертого комплекса, в котором четвертый сокомпонент обеспечивает специфический тропизм или привлечение отдельного класса клеток, например, путем включения белка ВИЧ, др 120, для нацеливания результирующего комплекса на Т4 лимфоциты, если основная цель обработать или предотвратить ретровирус.

Тот факт, что дтРНК содержится в составе тройного комплекса, в частности, в виде мицеллы, не только стабилизирует и защищает термолабильную дтРНК, это облегчает проникновение дтРНК внутрь клеток и усиливает действие ложноспаренной дтРНК. Мицеллярная структура дает улучшенный контакт лекарственного препарата с поверхностью клетки. Общий заряд мицеллы более притягателен и/или более совместим с большинством клеток. В противоположность "голая" ложноспаренная дт ДНК имеет высокий отрицательный заряд и может быть отброшена клеткой. Мицелла тройного комплекса дтРНК поглощается клеткой путем притяжения зарядов. Во-вторых, структура мицеллы позволяет дтРНК образовывать комплексы частиц, которые дают новый механизм фагоцитоза. Когда бы носитель (тройной комплекс) ни был сформирован, неизбежно образуются замечательные биоактивные фрагменты ложноспаренной дт РНК и эти биоактивные фрагменты желательны. Причина в следующем: рибонуклеазы, химическая причина, по которой образуются такие фрагменты, вездесущи и больше или меньше фрагментов действительно образуется, какой бы комплекс ни образовался. Способность образовывать мицеллы с этими биоактивными фрагментами представляет собой крайне необходимое условие увеличения полезности изобретения.

По мере того как фармацевтический препарат (крем, лосьон или подобное) будет стоять на полке фармацевта в ожидании употребления, в нем будут происходить неизбежные качественные биофизические изменения, хранение может быть при -4,7^oС или при температуре окружающей среды (обычно около 20^o С). Эти изменения предупреждены в данном изобретении, а именно: в предпочтительном воплочении продукт начинается с сердцевинной дтРНК ложноспаренного типа с целью построить тройной или четверной комплекс из этого исходного материала. Это на практике означает, что неизбежный распад макромолекулярной РНК будет освобождать биоактивные остаточные материалы меньшего молекулярного веса, которые будут комплексами с детергентом, что даст в результате слегка различные мицеллярные комплексы со сходными желаемыми фармакологическими свойствами.

Через некоторое время продукт продолжает проявлять биологическую активность, даже хотя число дтРНК сердцевины продолжает уменьшаться, поскольку число биоактивных фрагментов дтРНК родителя будет продолжать увеличиваться по мере того, как будут расцепляться РНК сердцевины. Т.о. биологическая активность продолжает сохраняться или слегка возрастает с течением времени по мере того, как высвобождаются потенциально биоактивные фрагменты дтРНК. Т.о. "стабильный", как использовано здесь, означает продукт, сохраняющий терапевтическую активность в течение времени.

Неионные детергенты, полезные в настоящем изобретении могут относиться по крайней мере к трем категориям /1/ имеющие эфирную связь, например, между гидрофильной и гидрофобной частями молекулы. Такие, как полиэтиленовые спирты, полиоксиэтиленовые эфиры или жирные кислоты, полиокси- этиленалкилфенолы или меркаптаны или элкиламины, /2/ имеющие эфирную или эфир-эфирную связь; /3/ имеющие амидную связь. Ионные детергенты также могут быть использованы, в частности, при образовании новых мицелл, которые дают быстро достигаемые высокие внутриклеточные концентрации дтРНК и их биоактивных фрагментов. Эфирные или амидные связи предпочтительны в контексте настоящего изобретения и некоторые примеры таковы: нонноксинол-9 (нонилфеноксиполиэтоксиэтанол), ритон- 100 (p=диизобутилфеноксиполиэтоксиэтанол), полиоксиэтилено- леил=эфир (называемый также Вrij 97) и Оникс OL (называемый также оникс OL 345). В изобретениях, которые описаны ниже, количество употребляемого детергента варьирует от 0,01 до 20% хотя предпочтительный уровень ниже 12 вес. при этом конечный результат зависит также от относительного содержания дтРНК, также как и от терапевтической цели (например, хладидия несколько более устойчива к тройному комплексу, чем HSV-2) и частной формы фармацевтического воздействия.

Предпочтительно количество ложноспаренной дтРНК варьирует от примерно 0,001 до 10 вес, состава или более, что зависит от конкретного состава (растворимость дтРНК нелимитирующий фактор в суспензиях) и условий предполагаемого применения продукта. При использовании фрагментов дтРНК верхний предел концентрации может быть немного выше, поскольку все ограничения растворимости подняты. Каким бы ни было относительное содержание дтРНК по отношению к детергенту в составе, баланс фармацевтического соединения может в общем входить в состав просто инертного физиологически приемлемого, фармацевтически подходящего носителя.

ДтРНК в основном упустили из виду в клиническом плане в качестве потенциальных антираковых и антивирусных лекарств из-за многих клинических проявлений токсичности и потери эффективности, связанных с первой проверенной клинически дтРНК полирибоинозиновой полицитидиловой кислоты (поли I-C или rIn-rCn). Однако ложноспаренные спирали дтРНК, которые вызывают намного меньшую индукцию фактора некроза опухоли (ФНО), высокотоксичного лимфокина (белка), приводящего к кахексии, имеют улучшенную терапевтическую активность и пониженную токсичность. Действительно, дтРКК более активна, чем интерферон против различных опухолей и вирусов, включая ВИЧ (Carter et al, Lancet, июнь 6, 1987).

Однако фармакологическое "составление" и хранение ложноспаренных дтРНК, формы дтРНК с наиболее предпочтительным на сегодня терапевтическим соотношением в исследованиях на человеке оказалось обременительной чертой или препятствием, которое преодолевается в настоящем изобретении. Данные показывают, что дтРКК, помещенная в водный раствор, должна быть введена в рецепиентное животное или в человека в течение 4 ч или выброшена за ненадобностью. Шаг "быстрое использование или выбрасывание" необходим, поскольку лекарство при температурах около 4^oС последовательно подвергается постепенной деградации, частично благодаря широкому распространению различных РНКаз, т. е. ферментов, которые расщепляют дтРКК, к которым ложноспаренные дтРНК частично чувствительны. Такие ферменты вездесущи по природе и присутствуют на руках, в слюне, в стерильной воде, на стекле и т.д. В настоящем изобретении образована новая группа тройных комплексов с сильно увеличенной стабильностью при различной температуре окружения. Ложноспаренные дтРНК, уязвимые для нуклеазной атаки, теперь окружены и комплексированы с поверхности, образуя тройной комплекс, продукты деградации дтРНК остаются активными, часть более активными, чем исходные соединения.

В статье Brodsky, Carter et al, J.Biol Res.Mod. том 4, стр.669, 1985 показано, что необходимо даже добавлять ингибиторы РНКаз во все пробирки, в которые вносятся образцы ложноспаренной дтРНК в течение лабильности (нестабильности), /б/ стабильность дт РНК in vivo очень невелика, измеряется только в минутах. Действительно, Т 1/2 (полужизни) введенной дтРНК (например, rIn r(C_11-14U)_n называемой также Ampligen рабочая марка HEM Research, Inc) в человеческой сыворотке составляет по оценкам 2015 мин. Разные люди имеют различные количества гидролитических ферментов.

Все люди, исследованные на сегодня (приблизительно 115 человек) имеют значимые уровни ферментов (эндо или экзо- нуклеаз), которые быстро деградируют дтРНК.

Это изобретение фармацевтический состав местного применения для обработки состояний, восприимчивых или чувствительных к обработке ложноспаренной дтРНК, таких как вирусные инфекции, рак кожи и подобное, в котором дтРНК местно применяется в биоактивной форме. Обычно термолабильная ложноспаренная дтРНК присутствует в тройном комплексе двух цепей PНK, ложноспаренных, как определено здесь, комплексированных с анионным, катионным или неионным детергентом. Активный компонент часто образует мицеллу с детергентом и может присутствовать в виде исходного компонента (ложноспаренной дт РНК) или в виде биоактивных фрагментов исходных компонентов.

Состояния, обработанные местным составом данного изобретения, включают те, которые чувствительны к терапии ложноспаренной дт РНК, и те состояния, при которых ложноспаренная дт РНК дает единственное средство воздействия. Эти состояния включают /1/ ретровирусные инфекции человека, включая ВИЧ, /2/ членов семейства вирусов герпеса, лихорадка и герпесный опоясывающий лишай /3/, цитомегаловирус или ЦТВ, иногда классифицируемый как вирус герпесного типа, /4/ локализованный рак кожи с вирусной этиологией и без нее /5/ восприимчивые вирусные состояния, передающиеся половым путем, и венерические инфекции, включая хламидии (многие из состояний, перечисленных выше, передаются половым путем) и /6/ венерические инфекции, при которых причинный вирусный агент первичен или вторичен по отношению к другой венерической инфекции, которая сам по себе нечувствительна или малочувствительна к дтРНК (ложноспаренной). Эта вторичная инфекция лечится другими терапевтическими средствами (например, конкурентная гонорейная инфекция, при которой пациент получает тетрациклиновую терапию); область применения не ограничивается указанными случаями.

Составы данного изобретения включают такие фармацевтические формы, как жидкости растворы, например изотонические глазные капли и капли для носа или спрэи, лосьоны, кремы, пены, гели и вязкие жидкости, включая смазки, хорошо подходящие для мочеполовой системы; твердые и полутвердые препараты мази, офтальмологическая мазь или крем, кремы, бальзамы, свечи (как ректальные, так и вагинальные), палочки типа губной помады, используемые для обработки повреждений при герпесной лихорадке и вставки в глаза. Под ложноспаренными дтРНК подразумеваются такие, в которых водородные связи (стэкинг оснований) между взаимодействующими цепями относительно интактны, т.е. прерываются в среднем реже, чем в одной паре оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Ложное спаривание представляет собой разрыв в нормальной геометрии двойной спирали РНК при впячивании (или выпячивании) цепей, которое представляет собой точки чувствительности дт РНК к расщеплению нуклеазами. Термин "ложноспаренная дт РНК" должен пониматься в соответствии с этим.

ДтРНК может быть комплексом полиинозината и полицитидилата, содержащего часть урациловых оснований или гуанидиновых оснований, например, от 1 на 5 до 1 на 30 таких оснований (поли- 1 поли (C_4-29 x > U или G) дт РНК может иметь общую формулу rIn.(C₁₂,U)_n. Другие подходящие примеры дт РНК обсуждаются ниже. rIn. (C₁₂, U)_n В предпочтительной ложноспаренной дтРНК участок, состоящий из непрерывной последовательности от 6 до 12 пар оснований, т.е. от полувитка до одного полного витка спирали РНК, служит одновременно биотригером, вызывающим освобождение лимфокинов и обязательным внутриклеточным кофактором ферментов, составляющих пригодный активирусный путь. Ложноспаренные районы вставлены в полипиримидиновую цепь для ускорения гидролиза дт РНК и т.о. предотвращая токсичность.

Ложноспаренные дтРНК, предпочтительные для использования в настоящем изобретении, основаны на кополинуклеотидах, выбранных из поли (Сn-G), в которых целое число, имеющее значение от 4 до 29, представляет собой ложноспаренные аналоги комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитинадовой кислоты, полученных модификаций rIn-rCn для внесения неспаренных оснований ( урацила или гуанидина) в полирибоцитидилатную (rCn) цепь. Альтернативно дт РНК может быть получена из поли /I/ поли /С/ дт РНК при модификации рибозильного остова полирибоинозиновой (rIn) кислоты, например, путем включения 2-метилрибозильных остатков. Эти ложноспаренные аналоги rIn-rCn наиболее предпочтительны, из которых имеют общую формулу rIn-r(C_11-14,U) и rIn-r(C₂₉,G)_n, Описаны Carter и Тs" о в патентах США N 4.130.641 и 4.024.222, раскрытие которых включены здесь при помощи ссылки др РНК описанные в них, в общем подходят для использования в соответствии с данным изобретением.

Другие примеры ложноспаренной дт РНК для использования в изобретение включают

поли /1/ поли (С₄, U)

поли /1/ поли (С₇, U)

поли /1/ поли (C₁₃ U)

поли /1/ поли (C₂₂ U)

поли /1/ поли (C₂₀,G)

поли /1/ поли (С₂₉,G)

поли /1/ поли (С₀/23/G>P

Изобретение может быть применено при добавлении другого лимфокина в тройному комплексу цель такого добавления в дальнейшем модуляции числа и природы клеток, доступных в реакции с местно примененной дт РНК. Например, добавление интерлейкинов к тройному комплексу обеспечит дальнейшее увеличение количества Т-лимфоцитов, а также возможность синэргетического терапевтического взаимодействия с дт РНК. Сходные обоснования дополнительной полезности могут существовать для комбинаций с другими лимфокина и, такими как интерфероны и факторы некроза опухоли, не ограничиваясь указанными. Эти лимфокины могут быть особо полезны при обработке местных раков и некоторых вирусных инфекций. В некоторых случаях также могут быть добавлены специфические ингибиторы, например азодитимидин или гангцикловир.

Чтобы проиллюстрировать возможности результирующего четвертого комплекса, приготовлен фармацевтический лосьон, обозначенный в тексте А, который содержал 5000 20000 ед. IL 2 и 10 мг. дрт РНК. Наносят щедрую порцию лосьона на кожу безволосой мыши непосредственно на район, который был предварительно инфицирован клетками меланомы человека (рака кожи). Будучи необработанными, такие введенные субкутанозно опухолевые клетки растут так, что со временем животное обезображивается опухолевой массой. Однако животное, получившее IL-2 (дт РНК) детергентный лосьон, демонстрировало быструю регрессию опухоли и преуспевало по сравнению со своими необработанными двойниками. Здесь анализируется субпопуляция иммунных клеток в их селезенках с использованием метода поточной цитометрии, в котором могут быть определены специфические количества иммунологически значимых клеток. По сравнению с необработанными прирост составил: клетки ПК (природные киллеры) 63% при обработке просто дт PНK по сравнению с 87% при комбинации с интерлейкином-2 (маркерные антитела, использованные в аппарате поточной итометрии, были ASGMI); клетки ЛАК (лимфокин-активируемые киллеры) 228% при просто дт РНК против 412% при комбинации с иктерлейкином-2 (маркерные антитела, использованные в аппарате поточной цитометрии, были Тhy 1,2) и лимфоциты Т4-отсутствие заметного прироста при обработке просто дтРНК против 263% при комбинации с интерлейкином-2 (маркерные антитела, использованные при поточной цитометрии были 3Т4). В качестве негативного контроля отмечено, что ни один из местно примененных лосьонов не повлиял на количество лимфоцитов Т8 (супрессоров) по результатам измерений в селезенке.

Лимфокины могут включать интерфероны, предпочтительно интерферон-альфа, интерлейкины, особенно интерлейкин 2 (IL-2) и рекомбикатный интерлейкин-2 (rIL-2) и фактор некроза опухоли (ФНО). Также вовлечены лимфокин- активируемые киллеры (ЛАК), образующиеся у животных в ответ на обработку лимфокинами. Ингибиторы обратной транскриптазы, такие как 3¹=азидо 3¹ дезокситимидин (АЗТ), могут быть включены в состав вместо лимфокина или в дополнение.

Когда в качестве лимфокина используется интерферон альфа, обеспечивается количество от 0,01 до 100000 на миллилитр жидкости тела пациента. Когда лимфокин IL-2, предпочтительно rIL 2, применяемое количество лежит в пределах от, примерно, 10² единиц IL- 2 на кг. веса тела пациента до значений, приближающихся к неприемлемым уровням токсичности для пациента, которые могут достигать 10⁶ единиц IL- 2 Однако наиболее эффективные уровни, дающие контролируемую токсическую реакцию, лежат в предела от приблизительно 10³ до 10⁴ единиц IL 2 на кг. веса тела.

Обычно количества применяемой дт РНК обеспечивают уровень от 0,1 до 1000 микрограмм дт РНК на миллитр жидкости тела пациента. Термин "жидкость тела" введен для ссылки на раствор: сыворотки, солей, витаминов и т.д. который циркулирует внутри организма омывает ткани. Когда применяются оба агента (дт РНК и лимфокин и/или ингибитор обратной транскриптазы), они обычно используются в виде смеси, но могут быть применены раздельно, но одновременно или последовательно.

Применение дт РНК и лимфокина "в комбинации" включает способы, в которых оба агента применяются вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которой два агента применяются отдельно, но одновременно. Применение "в комбинации" включает отдельное применение одного из лекарств, при котором одно из лекарств дается сначала, с последующим через короткий промежуток времени применением второго.

Наблюдается не отмечавшаяся прежде биохимическая аномалия, в которой ключевой фермент (РНК аза L), связанный с механизмом защиты тела от рака и вирусных болезней, действует ускоренным и, очевидно, неконтролируемым образом. В отдельном эксперименте сравниваются относительные способности двух этих различных клеток (клеток с аномальной РККазой L) противостоять вирусу. Титры вируса были существенно выше у клеток с аномальной РНКазой L, которые так быстро образуют NCP.

Двутяжевые РНК, особенно ложноспаренные дт РНК, восстанавливают нормальность кинетики и продуктов деградации РНКазы. Ход восстановления нормальности при помощи дт РНК может быть ускорен предварительной обработкой лимфокинами.

В экспериментах, описанных ниже, дт РНК сначала восстанавливали из лиофилизированных порошков и затем смешивали с растворами различных детергентов с упором на использование неионных детергентов.

В некоторых экспериментах использовался инертный носитель, особенно если целью была обработка результирующим комплексом поверхности или биологической полости и т.д. Комплекс дт РНК с детергентом инкубировали в течение ночи и затем разводили стандартным среднесолевым раствором для некоторых из опытов, описанных в табл. 1 и 2.

Необходимо понять, что эти новые фармацевтические составы могут быть местно применены большим разнообразием методов. Например, составы могут быть доставлены к пораженному району или к району, который еще не поражен, но обрабатывается профилактически, в микрокапсулированной форме, например, в виде липидных или липидподобных пузырьков. Они могут также быть доставлены в виде пасты, сирая, тампона, вагинальной или ректальной свечи или непосредственно на или внутрь презерватива в процессе изготовления. Последнее (введение в презерватив) невозможно без данного изобретения, которое сообщает длительную стабильность и биоактивность ложноспаренной дт РНК или ее биологически активных фрагментов при температуре окружающей среды (20-25^oС) и надежность продуктов при хранении. Например, настоящее изобретение может быть легко применено путем введения комплекса дт РНК (детергента) с использованием механического процесса, описанного Reddy в патент США N 4.415.548, описывающем изготовление смазанного спермицидного мужского контрацептива.

В частности, настоящее изобретение также позволяет преодолеть некоторые из нежелательных эффектов некоторых спермицидов, такие как популярный новоксинол-9 (нанилфеноксиполи- этоксиэтанол), поскольку изобретение позволяет снизить эффективную концентрацию ноноксинола 9 по крайней мере при некоторых показаниях (см. табл. 2). При применении этого спермицида отмечены вагинаты, также как некроз плаценты и эмбиотоксическое действием (Tryphones et al. Toxicology т. Э9 (2) Май стр. 177, 1986 г.)

Проведены сходные эксперименты с другими спермицидами, включая арил- 4 - гуанидинобензоатные ингибиторы (NPGB) акрозина спермы белка, играющего важную роль в процессе оплодотворения (J.Med.Chem (апр.) т. 29 (4), стр. 514, 1966).

Прочие спермициды, совместимые с настоящим изобретением, включают хлоргексидиндиацетат (Sharman et al. Fertil. Steril, т. 45(2) февр. стр. 259, 1986 менфегол /см. Lamptey et al. Contraception, 732(5), ноябрь, стр. 445, 1985); хлористый бензалконий не адсорбируется на вагинальной стенке, как ноноксинол= 9, как описано Zufferey, J.Gynecol. Obstet, Biol. Reprod, (Париж), Т14(3), стр. 359, 1985; и более современную двухфазную систему с ноноксиколом= 9, в которой смазывающая система содержит силиконовую жидкость плюс ноноксинол= 9 плюс спермицидный крем (Rodgers-Meame et al. Fertiliz. Steul. Vol 43(6), June, p. 931, 1985). В последнем случае очевидно, что приблизительно 2 мг. дт РНК может быть добавлено либо к смазывающей системе, содержащей 0,450,1 мл силиконовой жидкости с 6,60,45% детергента, или к спермицидному крему, состоящему из 0,45% 0,1 мл смеси полиэтиленгликоля 400 (приблизительно, 63%) и полиэтиленгликоля 3350 приблизительно 30%), или же к обоим компонентам. Выше даны просто не лимитирующие примеры совместимости изобретения в качестве дополнения к различным контрацептивам.

Немаловажно, что фармацевтические составы, которые описаны, проявляют как антимикробную, так и антивирусную активность (для примера см. табл. 2). Хотя это уже указывалось как возможно, в патенте США N 4.507.281, Asculai и Rapp. (в котором они комбинируют интерферон с ноноксинолом=9). Современные факты таковы, что интерфероны сами по себе или смешенные с детергектом относительно инертны против многих вирусов, в особенности вирусов иммунодефицита человека. Не существует указаний на новый макромолекулярный агрегат, как тот, который здесь описан, с впечатляющим сдвигом как в биологических свойствах, так и сопутствующим сдвигом в некоторых биофизических свойствах. В то время как наблюдается возрастание кажущегося молекулярного веса тройного комплекса, используя малоугловое рассеяние лазерного луча ( и приводя к S₂₀W с использованием рабочих уравнений), не обнаруживается изменения кажущегося молекулярного веса при аналитическом ультрацентрифугировании. Возможно потому, что парашютный эффект новой гидратационной оболочки тройного комплекса свел на нет кажущееся увеличение массы.

Табл. 1 и 2 демонстрируют типичные результаты изобретения. Результаты необычно впечатляющи как в отношении новых биофизических свойств (повышенная термостабильность тройного комплекса), так и в отношении новых биологических свойств (расширенный антивирусный и антимикробный спектр).

Далее следуют типичные примеры подходящих составов, содержащих неиомный детергент 1,2,3 и дт PНK:

Фармацевтический клем А, г:

Очищенная вода 41,00

Прозрачный воск 3,00

Ланолин 10,00

Петролатум 41,00

Сорбитан моноолеат 4,75

Полисорбат 80 0,25

дт РНК 10-160 мг.

Фармацевтический лосьон

Очищенная вода 7,00 мл

Олеиновая кислота 1,50 г.

Полиэтиленгликольмоностеарат 10,50 г.

Карбопол-934 45,25

Пропиленгликоль 24,75 мл

Триэтаноламин 1,00 мл

силиконовая жидкость 10,00 мл

дт РНК 10-180 мг.

Фармацевтический крем Б,

Спермацет 7,5

Воск 12%

Минеральное масло 56,0

Борат натрия 0,5

Сорбитанмоноолеат 5,0

Вода 19

дт РНК 1-200 мг.

Использованы следующие типы детергентов: 1 типичные эфирные или эфир= эфирные связи, такие как сорбитаны (моно или тристеараты), сзбитанмоноолеаты, сескэиолеаты, триоолеаты, полиоксиэтилен, сорбитанмонолаурат, сорбитанмонопальмитат.

2- типичные эфир= амидные связи, как, например, жирные алканоламиды, включая оникс О,L, унамид, моноамин, диэтаноламид лауриновой кислоты, такой как полисорбат 20, поли- сорбат- 80, оникс 01, р диизобутилфеноксил- полиэтокси- этанол, нонилфеноксиполиэтоксиэтанол, полиоксизтиленолеиловый эфир и т.п.

3 эфирные связи описаны в тексте и включают полиокси- этиленалкилфенолы, полиоксиэтиленспирты, полиоксиэтиленэфиры жирных кислот, полиоксиэтиленмеркаптаны и полиоксизтиленалкиламины и т.п.

Составлены также более сложные композиции, включая содержащие лимфокины или дт РНК связанные модиаторные вещества для определения их совместимости с настоящим изобретением. Конкретно, в местный препарат вводится в данном случае лосьон, интерферон и/или некоторые 2¹ -5¹ А сердцевинные малекулы, включая три 2,5 фосфоротиолаттримерных кора с RpRp, SpRp и RpSp междуклеотидными связями, которые активируют РНКазу L, связанную с внутриклеточным путем защиты хозяина. Такие продукты с удобными носителями, такими как униламиллярные липосомы, моноклональные антитела, реконструированные вирусные оболочки и т.п. могут быть доставлены в клетку, что обеспечит дополнительный уровень антивирусных, иммунологических и антираковых свойств. ТТТ1 ТТТ2