способ получения сшитого коллагена

Формула изобретения

Способ получения сшитого коллагена, включающий введение ацилазидных групп в молекулу коллагена с последующим сшиванием за счет взаимодействия ацилазидных групп коллагена с аминогруппами боковых цепей коллагена с образованием связей пептидного типа, отличающийся тем, что введение ацилазидных групп в молекулу коллагена осуществляют взаимодействием коллагена с дифенилфосфорилазидом в среде амидного растворителя при 0 10^oС, продукт взаимодействия коллагена с дифенилфосфорилазидом промывают до удаления дифенилфосфорплазида и выдерживают в буферном боратном растворе при 0 - 10^oС в течение 4 24 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам по- лучения сшитого дифенилфосфорилазидом коллагена, который составляет треть протеинов человека и животного и воздействует на рост клеток, а также используется в качестве исходного материала для биоматериала.

Известен способ получения сшитого коллагена путем введения азидных групп в карбоновые группы в боковых цепях коллагена. Способ осуществляется путем этерификации карбоновых групп коллагена с последующим преобразованием сложных эфиров в гидразиды и затем в ацилазиды, которые вступают в реакции в основной среде с аминированными функциями боковых цепей коллагена для образования связей пептидного типа (заявка Франции N А-8710317).

Однако этот способ продолжителен и для получения сшитого коллагена требуется 8 дн. Такая продолжительность способа не позволяет его использовать в промышленном масштабе.

Известен также способ получения сшитого коллагена, включающий введение ацилазидных групп в молекулу коллагена с последующим сшиванием за счет взаимодействия ацилазидных групп коллагена с аминогруппами боковых цепей коллагена с образованием связей пептидного типа (патент ЕПВ N 0301977, кл. С 08 Н 1/06, опубл. 01.02.89).

Однако данный способ также продолжителен и по этому способу для получения сшитого коллагена требуется 7 дн.

Технический результат изобретения состоит в сокращении продолжительности времени проведения способа.

Для достижения технического результата введение ацилазидных групп в молекулу коллагена осуществляют взаимодействием коллагена с дифенилфосфорилазидом в среде амидного растворителя при температуре 0-10^оС, продукт взаимодействия коллагена с дифенилфосфорилазидом промывают до удаления дифенилфосфорилазида и выдерживают в буферном боратном растворе при 0-10^оС в течение 4-24 ч.

На фиг.1 схематично изображен механизм реакции сшивки коллагена посредством реакции дифенилфосфорилазида (ДФФА) с карбоновыми группами коллагена; на фиг. 2 изменение степени сшивки (РТР) коллагена в измеренное от пиковой температуры денатурации (ТР) коллагена на перикарде теленка в зависимости от концентрации ДФФА; на фиг.3 изменение степени сшивки РТР в на пленках коллагена в зависимости от концентрации ДФФА.

На фиг. 1 карбоновый анион (а), который поступает от боковых карбоновых групп аспарагиновой или глутаминовой кислоты пептидных цепей коллагена, действует на атом фосфора ДФФА (b) для получения, в основном, фосфорсодержащего пентаковалентного соединения (с). Далее происходит миграция азидной группы атомов фосфора к карбоновому атому углерода через перегруппировку типа внутренней нуклеофильной замены. Образовавшийся ацилазид (d) вступает в реакцию с боковыми аминированными группами лизина и гидроксилизина пептидных цепей коллагена для получения связи амидного типа.

Способ осуществляется следующим образом.

П р и м е р 1. Сшивка посредством ДФФА перикарда теленка.

А. Подготовка исходного материала.

На скотобойнях отбирают перикарды теленка менее, чем за 1 ч после убоя. Затем эти перикарды обезжиривают и промывают в растворе NaCl 0,9% Затем их разрезают пробойником на таблетки в 1 см².

Б. Сшивка перикарда.

Эту реакцию можно описать следующим образом.

Четыре таблетки перикарда, предварительно промытые в 10 мл чистого ДМФ в течение 5 мин, с целью освобождения ткани от воды, выдерживают в течение 24 ч при 4^оС в 10 мл раствора диметилформамида (ДМФ), содержащего 0,75% ДФФА (концентрация, выраженная в объем/объем). Затем ткань освобождают от ДФФА путем промывки в 10 мл раствора ДМФ. Затем ДМФ удаляют путем промывки в 10 мл боратного буферного раствора с рН 8,9 (тетраборат натрия 0,04 М, борная кислота 0,04 М). Ткань выдерживают одну ночь в боратном буферном растворе с рН 8,9. Затем ткань сохраняют, например, в 70^о-ном растворе этанола.

П р и м е р 2. Сшивка посредством ДФФА пленки коллагена.

А. Подготовка исходного материала.

Гель получают из телячьих шкур, предпочтительно промытых и освобожденных от волос, смесью известь-сернистое соединение. Затем их обеззоливают в ванне, содержащей хлорид аммония (2%) и метабисульфит натрия. Затем их нейтрализуют и удаляют соли путем двух промывок водой. Затем их измельчают, промывают фосфатным буферным раствором с рН 7,8 (дигидрогенофосфат калия 0,78 г/л и динатриевый моногидрогенофосфат 21,7 г/л). Фосфат удаляют путем двух последовательных промывок со сменной водой. Затем измельченное вещество подкисляют 10% -ным раствором уксусной кислоты, при этом количество уксусной кислоты составляет 5% по отношению к коллагену. В этом случае измельченное вещество перемешивают с целью получения однородной массы. Затем эту массу разбавляют для получения геля, имеющего концентрацию коллагена в 0,7% Гель помещают в небольшие тефлоновые формы для выпаривания и полученную таким образом пленку разрезают пробойником на таблетки в 1 см².

Б. Сшивка пленки.

Эта реакция может быть описана следующим образом.

Четыре полоски пленки с поверхностью в 1 см² выдерживают в течение 24 ч при 4^оС в 10 мл раствора ДМФ, содержащего 0,25% ДФФА. Затем пленку освобождают от ДФФА путем промывки в 10 мл раствора ДМФ. Затем удаляют ДМФ путем промывки в 10 мл боратного буферного раствора с рН 8,9 (тетраборат натрия 0,04 М, борная кислота 0,04 М). Пленки выдерживают в течение одной ночи в боратном буферном растворе с рН 8,9. В этом случае их обезвоживают на бумажном фильтре, затем высушивают на свежем воздухе. Далее их стерилизуют, например, гамма-лучами.

Таким же образом обрабатывают губки, трубки, волокна из коллагена и т.д.

П р и м е р 3.

А. Влияние концентрации ДФФА на сшивку телячьего перикарда.

Первая часть работы заключается в изучении влияния концентрации ДФФА на степень сшивки перикарда. Для этого перикард выдерживают в растворах ДФФА с концентрациями, изменяющимися от 0,0125 до 1,5% (объем/объем).

Измерение степени сшивки коллагена выполняют путем калориметрического анализа с разверткой. Эта технология заключается в измерении при линейном повышении температуры энергетической разницы, которую следует подать на образец и на контрольный образец, чтобы выдерживать их при одинаковой температуре. Когда происходит денатурация коллагена, на регистраторе появляется пик поглощения теплоты. Таким образом определяют температуру начала денатурации Т_д, пиковую температуру денатурации Т_р и конечную температуру денатурации Т_г.

Для расчета процентного отношения ретикуляции R осуществляют следующий расчет:

R 100 где Т_М максимальная температура денатурации, которую можно получить при сшивке коллагена посредством ДФФА (в настоящем случае она соответствует температуре, полученной при концентрации ДФФА 0,75%);

Т₁ температура денатурации, полученная на необработанной ткани;

Т_Х температура денатурации, полученная на ткани с концентрацией ДФФА Х;

R сшивки, рассчитанный на основе Т_р, т.е. пиковой температуры денатурации, и названный RТ_p. Изменение RТ_p в зависимости от log [ДФФА]1000) показано на фиг.2.

Между 0,0125% и 0,50% изменение RТ_p в зависимости от log [ДММA]1000) является линейным, а начиная с 0,5-0,75% получают максимальную и постоянную сшивку независимо от концентрации ДФФА.

Если сравнить температуру денатурации, полученную при ДФФА 0,75% или 0,5% с температурой, полученной по способу, предложенному в заявке FR N А-8710317, то видно, что эти значения отличаются незначительно (табл.1).

Б. Влияние концентрации ДФФА на сшивку пленки коллагена.

Исследовали влияние концентрации ДФФА на степень сшивки пленки коллагена. Для этого пленку выдерживают в растворах ДФФА с концентрациями, изменяющимися от 0,0125 до 1,0% (объем/объем).

Так же, как с телячьим перикардом, рассчитывают изменение RТ_p в зависимости от log [ДФФА] 1000) (фиг.3). Между 0,0125% и 0,10% изменение RТp в зависимости от log [ДФФА]10000) является линейным. Максимум сшивки получают с концентрациями ДФФА от 0,25 до 0,5%

Если сравнивать температуру денатурации, полученную при ДФФА 0,15% или 0,5% с температурой, полученной по способу, предложенному в заявке FR N А-8710317, то видно, что эти значения отличаются незначительно (табл.1).

В. Анализ ДФФА после сшивки перикарда.

С целью определения ДФФА после сшивки выполняют анализ ДФФА посредством его фосфорной группы.

На первом этапе анализируют фосфор на материале, обработанном посредством ДФФА с различными концентрациями без проведения промывки. Обработанный материал просто высушивают в печи при температуре 110^оС. Анализ фосфора выполняют путем эмиссионно-плазменной спектрометрии после минерализации раствором хлорной и азотной кислот (2/3 / 1/3 объем/объем). Результаты выражают в процентном содержании фосфора по отношению к весу сухой ткани. Результаты приведены в табл.2.

На втором этапе анализируют фосфор на материале, обработанном посредством ДФФА с концентрациями от 0,5 до 1,0% после промывки ткани либо только в боратном буферном растворе, либо сначала с ДМФ, затем в боратном буферном растворе. Результаты приведены в табл.3.

Видно, что при концентрации ДФФА 0,5% остаточный фосфор даже после просто трех промывок боратным буферным раствором эквивалентен фосфору, найденному для перикарда, выдержанного в ДМФ без сшивающего агента (соответственно 0,09% и 0,1%).

Таким образом, видно, что нет ретикулирующего агента в ткани после сшивки.

Способ позволяет сшивку коллагена без введения агента сшивки и, кроме того, он легко воспроизводится в промышленном масштабе.