производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью

Формула изобретения

1. Производные таксола общей формулы I



где R и R₁ каждый являются остатком аминокислоты, выбранным из группы, состоящей из аланина, лейцина, изолейцина, салина, фенилаланина, пролина, лизина или аргинина или группы общей формулы II



где n 1, 2 или 3

R₂ и R₃ каждый является C₁-C₃-алкилом, или кислой аддитивной солью, при условии, что по крайней мере один из R и R₁ не водород, а также соединение общей формулы I не является 2 -( -аланил)таксолом.

2. Соединение по п.1, которым является 2 -(N, N-диметилглицил)таксол или его кислая аддитивная соль.

3. Соединение по п. 1, которым является 2 -(N, N-диметиламинопропионил)таксол или его кислая аддитивная соль.

4. Соединение по п.1, которым является 7-(N, N-диметилглицил)таксол или его кислая аддитивная соль.

5. Соединение по п. 1, которым является 2,7 -ди(N, N-диметилглицил)таксол или его кислая аддитивная соль.

6. Соединение по п.1, которым является 7-(аланил)таксол или его кислая аддитивная соль.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включающая активное вещество и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит производное таксола общей формулы I в количестве 0,01 2500,0 мг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к производным таксола, которые обладают лучшей водорастворимостью по сравнению с таксолом, и показывают хорошую противоопухолевую активность.

Указанные соединения предназначены для их использования при лечении тех же видов рака, при котором используется и таксол, а именно опухолей легких, меланом, лейкемии, лейкемии, рака молочной железы и рака толстой кишки.

Таксол является известным дитерпеноидом, сесквитерпеном, который получают из коры дерева тиса коротколистного, Taxus brevifolia, и который имеет следующую структуру:



Таксол также обладает сильной ингибирующей активностью против широкого ряда опухолей. Однако это соединение плохо растворяется в воде, что создает ряд значительных трудностей при изготовлении фармацевтических композиций, используемых для лечения опухолей у человека. Некоторые композиции таксола для инъекций или внутривенных вливаний изготавливаются, в основном с использованием кремофора Е1 в качестве наполнителя в целях устранения недостатка, связанного с низкой водорастворимостью таксола. Однако кремофор сам по себе является отчасти токсичным и вызывает идиосинкразическое высвобождение гистамина и анафиклактическиподобную реакцию, поэтому использование этого наполнителя, к сожалению, не является хорошим решением указанной выше проблемы разработки подходящих композиций таксола.

В соответствии с этим в результате исследований были получены производные таксола, которые, обладая лучшей водорастворимостью, чем таксол, показывают в то же время, такую же хорошую противоопухолевую и цитотоксичную активность, как и таксол.

Целью изобретения является получение производных таксола, обладающих хорошей противоопухолевой активностью и водорастворимостью.

Другой целью изобретения является изготовление композиций, содержащих производные таксола и нетоксичные носители, что позволит отказаться от использования токсичных носителей, таких, как кремофор.

Еще одной целью изобретения является получение производных таксола, которые обладали бы достаточно хорошей стабильностью при уровнях рН, подходящих для изготовления фармацевтических композиций (рН 3-4), но при этом обладали бы способностью быстро разлагаться in vivo при физиологических значениях рН (7,4), т.е. которые могли бы действовать, как предшественник таксола.

Эти и другие цели изобретения могут быть осуществлены путем разработки получения производных таксола, обладающих хорошей противоопухолевой активностью и водорастворимостью.

Новые производные таксола данного изобретения могут быть, в основном, представлены как 2"-и/или 7-сложные эфиры таксола, имеющие формулу I:

I

где R и R" каждый является Н или остатком аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аланина, лейцина, изолейцина, валина, фенилаланина, пролина, лизина, или аргинина; или группой формулы



III где n является целым числом от 1 до 3;

R² и R³ каждый является водородом или алкилом, имеющим 1 3 атомов углерода.

Если в указанной формуле R² и/или R³ не являются водородом, то эти соединения могут рассматриваться как так называемые "алкилированные аминокислоты". Таким образом, соединения формулы I, в более широком смысле, могут рассматриваться как 2"-и/или 7-сложные эфиры таксола с аминокислотами или алкилированными аминокислотами.

Таким образом, изобретение включает в себя: а) производные, этерифицированные при 2"-гидроксильной группе таксола; b) производные, этерифицированные при 7-гидроксильной группе таксола; и с) производные, этерифицированные при 2"- и 7-положениях гидроксильных групп.

Среди соединений, описываемых указанной выше общей формулой I, предпочтительными соединениями изобретения являются следующие соединения:

1. 2"-(N,N-диэтиламинопропионил)таксол

2. 2"-(N,N-диметилглюцил)таксол

3. 7-(N,N-диметилглицил)таксол

4. 2",7-ди-(N,N-диметилглицил)таксол

5. 7-(N,N-диэтиламинопропионил)таксол

6. 2",7-ди(N,N-диэтиламинопропионил)таксол

7. 2"-(L-глицил)таксол

8. 7-(L-глицил)таксол

9. 2",7-ди(L-глицил)таксол

10. 2"-(L-аланил)таксол

11. 7-(L-аланил)таксол

12. 2"7-ди(L-аланил)таксол

13. 2"-(L-лейцил)таксол

14. 7-(L-лейцил)таксол

15. 2",7-ди(L-лейцил)таксол

16. 2"-(L-изолейцил)таксол

17. 7-(L-изолейцил)таксол

18. 2"-7-ди(L-изолейцил)таксол

19. 2"-(L-валил)таксол

20. 7-(L-валил)таксол

21. 2",7-ди(L-валил)таксол

22. 2"-(L-фенилаланил)таксол

23. 7-(L-фенилаланил)таксол

24. 2",7-ди(L-фенилаланил)таксол

25. 2"-(L-пропил)таксол

26. 7-(L-пропил)таксол

27. 2",7-ди(L-пропил)таксол

28. 2"-(L-лизил)таксол

29. 7-(L-лизил)таксол

30. 2",7-ди(L-лизил)таксол

31. 2"-(L-глутамил)таксол

32. 7-(L-глутамил)таксол

33. 2"7-ди(L-глутамил)таксол

34. 2"-(L-аргинил)таксол

35. 7-(L-аргинил)таксол

36. 2"-7-ди(L-аргинил)таксол

При исследованиях было обнаружено, что 2"- и 7-гидроксильные группы таксола, особенно 2"-гидроксильная группа, являются более химически активными, чем 7-гидроксильная группа. И этот факт лег в основу получения производных изобретения.

Для получения сложных эфиров аминокислот использовалась следующая реакционная схема:

Схема II

N защищенная аминокислота + таксол __ 2-

Согласно схеме II реакцию защитных аминокислот проводят в присутствии конденсирующего реагента и необязательно в присутствии катализатора, предпочтительно, при комнатной температуре.

Подходящими конденсирующими реагентами являются карбодиимиды, такие, как дициклогексилкарбодиимид (DCC).

Подходящими катализаторами являются 4-диметиламино-пиридин (ДМАП) и пиридин.

В реакционной схеме II в качестве исходных материалов могут быть использованы различные известные амино-защитные группы и коммерческие доступные защищенные аминокислоты. Для этой цели могут быть использованы аминокислоты, защищенные t-BOC, FMOC или карбобензилокси-группой (CBZ). Предпочтительными являются аминокислоты, защищенные t-BOC или FMOC-группами. Хотя разблокирование t-BOC-группы на 2"-сложных эфирах с использованием водной муравьиной кислоты и других органических кислот и приводит к деградации продукта, а также к стереохимической модификации этого продукта, однако, использование 99% муравьиной кислоты дает лучшие результаты. В случае сложных эфиров FMOC-защищенных аминокислот, восстановление продукта зависит от рабочих условий реакции. Таким образом, в конечной стадии разблокирования конкретные условия, используемые для удаления t-BOC-защитной группы, могут вызвать нежелательные модификации у свободной гидроксильной группы в 7-положении молекул таксола. Эти нежелательные модификации, очевидно, являются следствием стереохимических модификаций молекул.

Примерами N-защищенных аланиновых соединений являются следующие соединения:

C

Как указывалось выше, было обнаружено, что 2"-гидроксильная группа таксола является более химически активной, чем 7-гидроксильная группа. Таким образом, в обеих схемах, указанных выше (схема I и cхема II), замещение или этерификация направлены на 2"-положение и осуществляются путем взаимодействия алкилированной или N-защищенной аминокислоты с таксолом при молярном соотношении 1:1 или слегка превышающим 1:1. Указанная реакция, проводимая с использованием разных молярных количеств, приводит к получению значительного избыточного количества производного 2"-сложный эфир-таксола, хотя при этом могут образовываться небольшое количество 7-сложный эфир-таксол-производного, как побочного продукта.

Получение 7"-позиционных сложных эфиров

Схема III

Поскольку 2"-гидроксильная группа таксола является более активной, чем 7-гидроксильная группа, то указанная этерификация требует применения процедуры, отличной от той, что используется для получения 2"-производных. Таким образом, для получения 7-сложных эфиров использовалась процедура, с помощью которой 2"-гидроксильная группа сначала блокировалась, затем 7-гидроксильная группа подвергалась этерификации и, наконец, 2"-защитная или блокирующая группа удалялась.

ои

Для блокирования 2"-положения таксола могут быть использованы ряд защитных групп, известных специалистам. В приведенной ниже схеме представлен пример использования защитной группы и алкилированной аминокислоты:



В приведенной выше реакционной схеме реакцию 2" troc-таксола и алкилированной аминокислоты проводят в присутствии конденсирующего реагента и катализатора. Подходящими конденсирующими реагентами и катализаторами являются те же реагенты и катализаторы, которые были указаны выше для схем I и II.

Разблокирование 2"-(troc)-таксола может быть осуществлено, например, путем использования смеси цинка и уксусной кислоты.

Схема IV

В качестве альтернативного варианта производные 7-замещенного таксола могут быть получены при помощи процедуры, которая заключается в том, что сначала таксол подвергают взаимодействию с 2-3 эквивалентами N-защищенной аминокислоты в целях получения 2-7-двузамещенного таксола, затем подвергают разблокированию 2"- и 7-аминокислоты, и наконец, отщепляют 2"-аминокислоту. Эта процедура схематически может быть представлена следующим образом с использованием t-BOC защищенного аланила:



В этой процедуре, аналогичной процедуре схемы III, реакция таксола и защитной аминокислоты протекает в присутствии конденсирующего реагента и катализатора. Разблокирование аминокислот проводили методом, обычно используемым для разблокирования аминокислот, например, с помощью муравьиной кислоты.

Расщепление 2"-аминокислоты проводили путем доведения рН раствора 2", 7-(аминокислота) таксола до 7-7,4, например с помощью смеси 2",7-ди(аминокислота) таксола в фосфатном буфере рН 7-7,4. Корректировка рН указанным способом приводит к расщеплению 2"-аминокислоты с образованием целевого 7-(аминокислота) таксола.

Таким образом, например, таксол подвергают реакции взаимодействия с 2-3 мол. эквивалентом N-замещенной аминокислоты (t-BOC, CBZ или FMOC-защищенной) в метиленхлориде в присутствии DCC и каталитического количества 4-диметиламинопиридина. В этом способе защищенную аминокислоту вводят в 2"- и 7-положение. Защитные группы удаляют с помощью соответствующего разблокирующего агента (например, кислоты, слабого основания, гидрогенолиза). Производное 2", 7-бис-аминокислота таксола выдерживают в течение 24-48 ч в фосфатном буфере при нейтральном рН, в результате чего происходит селективное разблокирование в 2"-положении с образованием 7-замещенного производного таксола.

Аналогичная реакционная схема может быть также использована для получения 7-замещенных производных таксола с помощью алкилированных аминокислот. Указанная реакция аналогична описанной выше, за исключением того, что проводили замещение, N-защищенной аминокислоты нужной алкилированной аминокислотой, а стадию разблокирования не проводили. Эта схема может быть представлена следующим образом.

Схема V

Таксол+ 2,7-(двузаме2

С. Получение производных 2",7-двузамещенного таксола

Двузамещенные производные могут быть получены с помощью процедур, указанных ниже, или части этих процедур.

Схема VI: Замещение алкилированными аминокислотами

Таксол+ е алкилированная)

Схема VII: Замещение аминокислотами

Таксол+ __ а

Схема VI, в основном, аналогична схеме I (см.выше), за исключением того, что реакция протекает с 2 эквивалентами алкилированной аминокислоты. Кроме того, реакция схемы I не требует обязательного присутствия катализатора, а реакция схемы VI должна протекать в присутствии катализатора, вследствие меньшей химической активности 7-гидроксильной группы таксола.

Схема VII, в основном, аналогична схеме II. Однако в связи с этим следует отметить, что в схеме VI предпочтительной защитной группой является FMOC-группа, которая позволяет избежать стеариновых модификаций в 7-положении во время стадии разблокирования. Такой проблемы, однако, не существует при реакции схемы VII, поскольку 7-гидроксильная группа является свободной. Таким образом, в указанной схеме могут быть использованы различные известные защитные группы, включая обе t-BOC и FMOC-группы.

Очевидно, что любой специалист, используя приведенные выше описания, может получить соединения данного изобретения в полном объеме.

Примеры предпочтительного осуществления изобретения.

П р и м е р 1. 2"-(N,N-диметиглицил)таксол или его соль



а) Соединение 1: 2"-(N,N-Диметиглицил)таксол

К раствору таксола (0,21 г, 0,246 ммоль) и N,N-диметиглицина (0,0264 г, 0,246 ммоль) в безводном метиленхлориде (12 мл) добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,15 г, 0,72 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,025 г, 0,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 дня в безводной среде, после чего добавляли еще 50 г DCC и продолжали перемешивать еще 6 ч. Реакционную смесь отфильтровывали и фильтрат выпаривали в присутствии азота. Остаток хроматографировали на силанизированном силикагеле (35 г, 26 см) и последовательно элюировали смесью этилацетата и петролейного эфира (1:1) и этилацетатом, после чего фракции этилацетата петролейного эфира медленно выпаривали и полученное твердое вещество фильтровали. Маточный раствор концентрировали и добавляли петролейный эфир до тех пор, пока не появлялось помутнение, после чего его отбрасывали. В результате получали 0,14 г (61%) соединения (т. пл. 168-171^оС, разл. ). В ЯМР-спектре соединения (300 МГц, CDCl₃) резонансы 2"-протона давали сдвиг от 4,71 ppm в таксоле до 5,59 ppm, что соответствует этерификации в 2-положении. Все остальные резонансы спектра находятся в соответствии с предполагаемой структурой. БЭЖХ-чистота составляла 98-99,5% Масс-спектроскопия: (FAB) m/e 939 (M + H)⁺.

Элементный анализ: C₅₁H₅₈N₂O₁₅

Вычислено, C 65,26; H 6,22; N 2,98

Найдено, С 65,16; Н 6,28; N 3,13

b) Соединение 2: Метансульфоновая кислая соль 2"-(N,N-диметилглицил)таксола

2"-(N, N-диметилглицил)таксол (0,06 г, 0,064 ммоль) растворяли в т-бутаноле (2 мл) и воде (1,5 мл). Смесь охлаждали до -5^оС и по капле добавляли метансульфоновую кислоту (3,1 мл, 2 мг/мл, 0,0645 моль), после чего смесь перемешивали при 0 -5^оС в течение одной минуты и фильтровали через 20 мкм фильтр (миллипористый) и помещали в колбу, охлажденную в смеси льда и изопропанола. Раствор сушили вымораживанием и получали в результате 0,058 г продукта (88%), т.пл. 170-173^оС.

Элементный анализ: C₅₂H₆₂N₂SO₁₈ x x2H₂O

Вычислено, C 57,83; H 6,27; N 2,6

Найдено, С 57,49; Н 6,06; N 2,73

Физические свойства: Мол. м 1035 Т.пл. 170-173^оС (разл.) Растворимость 15 мг/мл (слегка

мутный)

2 мг/мл (светлый)

Исследования химической стабильности.

Полученное соединение подвергали испытанию на стабильность в соответствии со следующими процедурами.

Исследовались производные при различных рН при 25^оС и 37^оС. Исследования плазмы проводили при 37^оС с использованием плазмы человека и крысы. Человеческую плазму получали из госпиталя Watkins, а крысиную плазму получали из Канзаского университета (animal lare Unit). Концентрация производного составляла около 20-25 мкг/мл. Маточный раствор соединения получали в количестве 0,8-1,0 мг/мл и добавляли к плазме до нужной концентрации (20-25 мкг/мл). 100 мкл образцов удаляли и резко охлаждали с помощью 250 мкл ацетонитрила и центрифугировали с целью осаждения плазменных белков. Кинетику деградации исследовали с помощью ВЭЖХ с построением графика зависимости площади цика от времени. Были рассчитаны t₉₀ и t₅₀. Исследования плазмы и химические исследования осуществляли с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с использованием РР-8-колонки (15 см) и форколонки (5 см). Детектор устанавливали при 227 нм. Подвижная фаза состояла из 0,02 М ацетат (рН5): ацетонитрила 50:50 или 35:65 и скорость потока варьировалась в пределах 1-1,5 мл/мин или эта фаза состояла из тех же растворителей, содержащих 0,001 М тетрабутиламмонийбисульфата, а скорость потока составляла 1 мл/мин.

При изучении стабильности исчезновение пика соединения приводит к образованию пика, имеющего время удержания, соответствующее таксолу. Идентификации этого пика была, кроме того, подтверждена при помощи исследований деградации новых производных. Таким образом, 2"(DMC) таксол инкубировали с водой при 37^оС и полученный продукт концентрировали и очищали с помощью препаративной ТСХ. После очистки продукт анализировали путем ВЭЖХ и спектроскопических методов. Продукт показал пик молекулярного иона при m/e 860 (M+Li)⁺, что подтверждает тот факт, что полученный продукт является таксолом.

Рабочие условия ВЭЖХ. Колонка RP-8, 150 мм (длина),

4,6 мм внутр.диаметр) Подвижная фаза 0,02 М ацетат (рН 5);

ацетонитрил 50:50. Детектор Kratos spectroflow Скорость потока 1 мл/мин Время удержа- ния 11,2 мл (соединение 2)

5,5 мл (таксол)

Результаты исследования химической стабильности. Условия t_1/2, ч 0,02 М ацетат 0,1 мг/мл (рН 3,5, 25^оС) 96,2 (рН 4,5, 25^оС) 55,4 Вода 2 мг/мл (рН 3,8, 37^оС) 89,8

Стабильность плазмы, 37^оС Условия t_1/2 мин Плазмы крысы 20 мкг/мл 3,05 Плазма собаки 20 мкг/мл 121,6 Плазма человека 20 мкг/мл 198,6

П р и м е р 2. Соли 2"(N,N-диэтиламинопропионил)таксола



а) Соединение 3: HCl-соль 2"-(3-N,N-диэтиламинопропионил)таксола

К раствору таксола (0,12 г, 0,14 ммоль) в CH₂Cl₂ (12 мл) содержащий гидрохлоид N, N-диэтиламинопропионовой кислоты (0,025 г; 0,145 ммоль) добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,08 г, 0,38 мМ) и 4-диметиламинопиридин (0,01 г, 0,081 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь фильтровали и фильтрат выпаривали в присутствии азота. Неочищенный материал хроматографировали на колонках с силанизированным силикагалем (18 г, 22 см) и последовательно элюировали смесью этилацетата и петролейного эфира (1:2), смесью этилацетата и петролейного эфира (1: 1) и этилацетатом. Фракции смеси этилацетата и петролейного эфира при медленном выпаривании образовывали твердый преципитат, который затем отфильтровывали. Маточные растворы, содержащие продукт, объединяли, концентрировали и добавляли до тех пор, пока раствор не становился мутным, после чего его отбрасывали. После фильтрования получали 0,068 г продукта (48% ), Т. пл. 188-191^оС, MC (FAB) m/e 981 (M+H)⁺. ЯМР (330 Гц, CDCl₃) показал, что 2"-протонные резонансы от 4,71 ppm в таксоле до 5,53 ppm N-этильные группы показывали метиловый резонанс А 1,0 ppm и СН₂-резонанс An 2,52 ppm. Все остальные характеристики резонансов соответствовали ожидаемому соединению.

Элементный анализ C₅₄H₆₅CIN₂O₁₅

Вычислено, C 63,73; H 6,43; N 2,75;

Найдено, C 64,84; H 6,84; N 2,89.

Физические свойства соединения 3. Мол.м. 1017,56 Т.пл. 186-189^оС (разл.) Растворимость 0,8 мг/мл

Условия ВЭЖХ Колонка RP-8, 150 мм (длина),

4,6 мм (внутр.диаметр) Подвижная фа- за 0,02 М ацетат (рН5): ацетонитрил 35:65 Детектор Kratos Spectroflow Скорость потока 1,5 мл/мин

Время удержания 16,71 мл (соединение 3)

Химическая стабильность Условия t_1/22, ч 0,02 М ацетата (0,01 мг/мл рН 3,5,25^оС) 438,6 0,02 М фосфата (0,02 мг/мл рН 7,4,25^оС) 0,25

Стабильность плазмы, 37^оС Условия t_1/2, мин Плазма челове- ка 4,2

b) Соединение 4: Метансульфоновая кислая соль 2"(N,N-диэтиламинопропионил)таксола

Для получения метансульфоновой кислой соли N,N-диметиламинопропионовой кислоты 10 г ОАВ-сефадекса (Pharmacia) смачивали 0,1 М NaCl в течение 75 ч и 75% полученного материала вливали в колонку. Колонку промывали дистиллированной водой (700 мл). Затем колонку уравновешивали 500 мл СH₃SO₃Na (получали из 0,5 М метансульфоновой кислоты и 0,5 М гидроокиси натрия и титровали для рН 6). Полное исчезновение Cl- оценивали путем сбора элюата и тестирования на Cl- путем добавления несколько капель 1% нитрата серебра в нескольких каплях азотной кислоты. После чего колонку промывали дистиллированной водой до нейтрального рН.

2,5 г HCl-соли N,N-диэтиламинопропионовой кислоты в 15 мл воды выливали в колонку и элюировали водой. Собирали 4 фракции по 50 мл. Первые несколько фракций содержали продукт. Эти фракции объединяли, а растворитель удаляли. Остаток растворяли в смеси метиленхлорида и этанола и высушивали в присутствии сульфата магния, после чего растворитель удаляли и получали 3,1 г продукта. Этот продукт осаждали из этанола и эфира, а в результате чего получали 2,6 г метансульфоновой кислой соли N,N-диэтиламинопропионовой кислоты.

К раствору таксола (0,05 г, 0,058 ммоль) и метансульфоновой кислой соли N, N-диэтиламинопропионовой кислоты (0,014 г, 0,058 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,061 г, 0,3 ммоль). Смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре, затем реакционную смесь фильтровали, а фильтрат выпаривали в атмосфере азота. Остаток хроматографировали на колонке с силанизированным силикагалем и элюировали смесью этилацетата и петролейного эфира (1:1) и этилацетатом. После медленного выпаривания фракций этилацетата: петролейного эфира получали 0,048 г продукта (74%). Т.пл. 170-174^оС.

Физические свойства. Мол.м. 1077,12 Т.пл. 170-174^оС Растворимость > 10 мг/мл ВЭЖХ-чистота > 99%

Химическая стабильность. Условия t_1/2, ч 0,02 М ацетата (рН 4,5,25^оС) 305 0,02 М ацетата (рН 5,5, 25^оС) 20,7

П р и м е р 3. Получение 7-(N,N-диметилглицил)таксола или его соли



a) 2"-(troc) таксол (соединение 5)

Таксол (0,27 г, 0,316 ммоль) растворяли в CH₂Cl₂ (10 мл) и пиридине (1,5 мл). Реакционную смесь охлаждали до-20-(-25^о)С и добавляли 2,2,2-трихлороэтилхлороформат (80 мкл). Затем реакционную смесь перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. После добавляли еще 25 мкл хлороформата и полученную смесь перемешивали в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли СН₂Cl₂ (50 мл) и последовательно промывали 0,1 н. HCl (25 мл х 2), 0,05 М холодного NaHCO₃ (25 мл х 1) и водой. Органический экстракт осушали безводным MgSO₄, а растворитель удаляли. По- лученный материал осушали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем, проявляли в смеси этилацетата и петролейного эфира (1:3), фракцию выше таксола отделяли, элюировали этилацетатом, а растворитель удаляли, в результате чего получали 0,32 г (97%) продукта, т.пл. 221-226 (разл. размяг. 160^оС).

b) 2"-(troc)-7-(N,N-диметилглицил)таксол (соединение 6)

Смесь 2"-(troc)таксола (0,27 г, 0,262 ммоль) и N,N-диметилглицина (0,054 г, 0,524 ммоль) растворяли в СH₂Cl₂ (15 мл). К этому раствору добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,215 г, 1,04 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,025 г, 0,2 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение двух дней при комнатной температуре. затем смесь фильтровали, а растворитель удаляли. Полученный продукт очищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем и проявляли в смеси этилацетата и петролейного эфира (1: 1). Фракцию ниже таксола (Rf 0,47, этилацетата: петролейный эфир (1:1)) отделяли и элюировали этилацетатом, после чего растворитель удаляли и получали 0,26 г продукта (89%). Т.пл. 176-180^оС (раз.).

Элементный анализ: C₅₄H₆₀Cl₃N₂O₁₇

Вычислено, С 58,16; Н 5,42; N 2,51

Найдено, С 58,68; Н 6,00; N 3,18.

с) 7-(N,N-диметилглицил)таксол (соединение 7)

К раствору 2"(troc)-7-(N,N-диметилглицид)таксола (0,335 г, 0,3 ммоль) в смеси метанола и уксусной кислоты (9:1) (12 мл) добавляли цинковую пыль (0,275 г), и по- лученную смесь перемешивали в течение 25 мин при комнатной температуре. Затем смесь фильтровали, фильтрат концентрировали до 1 мл и разбавляли CH₂Cl₂ (35 мл), а затем последовательно промывали 0,01 М HCl (20 мл Х 2), 0,01 М холодного NaHCO₃ и водой. Органический экстракт осушали безводным Na₂SO₄, растворитель удаляли и получали 0,24 г продукта. Это соединение очищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем (20 х 20, 3 NOS) и проявляли в смеси CH₂Cl₂: этилацетата (7:1). Фракцию, относящуюся к 7-(DMG)таксолу (R_f 0,35), отделяли и элюировали этилацетатом и этанолом, затем растворитель удаляли и получали 0,19 г продукта (68% ). MC(FAB) m/e 939 (М+Н)⁺. В ЯМР-спектре (300 МГц, CDCl₃) резонансы 7-Н при 4,33 ppm в таксоле появлялись в виде двойного дублета при 5,65 ppm -(СН₃)₂-резонанс появлялся в виде синглета при 2,35 ppm. Метилановая группа глицината обнаруживалась при 3,16 ppm.

d) Метансульфоновая кислая соль 7-(диметиглицил)таксола (соединение 8)

7-(Диметилглицил)таксол (0,065 г, 0,069 ммоль) растворяли в I-бутаноле (2,5 мл) в воде (1 мл). Раствор охлаждали до 5-10^оС и добавляли метансульфоновую кислоту (3,36 мл, 2 мг/мл, 0,0697 ммоль). Смесь перемешивали в течение 2 мин, фильтровали через миллипористый фильтр в пробирку, охлаждаемую льдом. Фильтрат осушали вымораживанием и получали 0,066 г продукта (94%). Т. пл. 164-168 (разл.).

Элементый анализ: C₅₂H₆₂N₂O₁₈ 2H₂O

Вычислено, C 58,29; H 6,19; N 2,6%

Найдено, С 58,05; Н 6,00; N 1,72%

Физические свойства. Мол. м. 1035 Т.пл. 164-168^оС Растворимость: > 2 мг/мл

ВЭЖХ-условия Колонка RP-8, 150 мм (длина),

4,6 мм (внутр.диаметр) Подвижная фаза 0,02 М ацетата (рН 5):

ацетонитрила 35: 65 Детектор Kratos Spectroflow Скорость потока 1,5 мл/мин Время удержа- ния 15,07 мл (соединение 8)

Химическая стабильность. Условия t_1/2, ч 0,02 М ацетата (рН 3,5,25^оС) 3397 0,02 М ацетата (рН 4,5,25^оС) 1719 0,02 М фосфата (рН 7,4,25^оС) 33,8 ч

Стабильность плазмы, 37^оС Условия t_1/2, ч Плазма крысы 20 мкг/мл 17,3 Плазма человека 20 мкг/мл 27,7 Плазма человека 10 мкг/мл 24,4

П р и м е р 4. Получение 2",7-(диметилглицил)таксола



Таксол (0,06 г, 0,00702 ммоль) растворяли в безводном метиленхлориде (5 мл) и добавляли N,N-диметиглицин (0,015 г, 0,145 ммоль). К полученной смеси добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,08 г, 0,388 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,008 г, 0,065 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре и фильтровали. Затем растворитель удаляли из фильтрата. Остаток, счищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем и проявляли в смеси этилацетата и петролейного эфира (1: 1). Фракцию (R_f0,17) выше диметиламинопиридина отделяли и элюировали смесью этилацетата и этанола, а растворитель удаляли. Остаток перекристаллизовывали смеси этилацетата и петролейного эфира, в результате чего получали 0,046 г продукта (64%). Т.пл. 194-198^оС. MC: m/e 1024 (М⁺). В ЯМР-спектре (300 МГц, CDCl₃) С₂-протон 4,71 ppm и С₇-протон 4,33 ppm сдвинуты к 5,5 ppm и 5,6 ppm соответственно, что свидетельствует о этерификации в 2"- и 7-положении. Зафиксирован также -СН₃-протон в виде синглета при 2,3 ppm.

Элементный анализ: C₅₅H₆₆N₃O₁₆

Вычислено, C 63,39; H 6,48; N 4,03

Найдено, С 63,00; Н 6,98; N 3,98%

ВЭЖХ-условия Колонка RP-8, 150 мм (длина),

4,6 мм (внутр.диаметр) Подвижная фаза 0,02 М ацетата (рН 5):

ацетонитрила 35: 65 Детектор Kratos Spectroflow Скорость потока 1,5 мл/мин Время удержа- ния 15,07 мл (соединение 8)

Химическая стабильность. Условия t_1/2, ч 0,02 М ацетата (рН 3,5,25^оС) 3397 0,02 М ацетата (рН 4,5,25^оС) 1719 0,02 М фосфата (рН 7,4,25^оС) 33,8 ч

Стабильность плазмы, 37^оС Условия t_1/2, ч Плазма крысы 20 мкг/мл 17,3 Плазма человека 20 мкг/мл 27,7 Плазма человека 10 мкг/мл 24,4

П р и м е р 5. Получение 7-(L-аланил)таксола или его соли

а) 2"-7-ди(t.BOC-L-аланил)таксол

К раствору таксола (0,021 г, 0,246 ммоль) и N-t, BOC L-аланина (0,14 г, 0,739 ммоль) в метиленхлориде (15 мл) добавляли 1,3-дициклогексилкарбодиимид (0,25 г, 1,21 ммоль) и диметиламинопиридин (0,025, 0,20 ммоль). Смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Остаток хроматографировали на колонках с силанизированным силикагелем (20 г, 14 см) и элюировали этилацетатом: петролейным эфиром (1:1) и этилацетатом. Фракции этилацетата-петролейного эфира, содержащие распределенное производное, выливали, а растворитель удаляли, в результате чего получали 0,27 г соединения (92%). Т.пл. 158-161^оС (разл.).

b) 7-L-аланил таксол

2,7-ди-(t,BOC-L-аланил)таксол (0,29 г, 0,242 ммоль) и муравьиную кислоту (2 мл) смешивали при комнатной температуре в течение 40 мин и избыток муравьиной кислоты удаляли в присутствии азота. Остаток растворяли в этаноле и добавляли петролейный эфир. Твердое вещество отфильтровывали и получали 0,27 г 2", 7-ди(аланил)таксола.

Полученное таким образом диаланиловое производное разводили в ацетонитриле (4 мл) и фосфатном буфере (0,02 М рН 7,4, 50 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. рН раствора повышали до 6,8, используя небольшое количество (мл) 5%-ной Na₂HPO₄. Мутный раствор перемешивали при комнатной температуре еще 8 ч. Затем реакционную смесь разбавляли метиленхлоридом (50 мл) и добавляли холодный NaHCO₃ (0,05 М, 50 мл). Затем реакционную смесь экстрагировали метиленхлоридом (50 мл х 3), а полученный органический экстракт один раз промывали водой и высушивали безводным сульфатом натрия. После чего растворитель удаляли и получали 0,24 г продукта. Это соединение очищали с помощью хроматографии на колонках с силанизированным силикагелем и получали 0,135 г продукта (63%) Чистота 95% Т.пл. 159-163^оС. Масс-спкетр: (FAB) m/e 925 (М+Н)⁺. В ЯМР-спектре (300 МГц, CDCl₃) 7-H при 4,33 ppm в таксоле зафиксирован в виде двойного дублета при 5,65 ppm. СН₃-группа на молекуле аланина зафиксирована в виде дублета при 1,27 ppm.

Элементный анализ H C₅₀H₅₈N₂O₁₆ x x 2,5 H₂O

Вычислено, С 61,91; Н 6,54; N 2,89.

Найдено, С 61,41; Н 6,59; N 22,78%

с) Метансульфоновая кислая соль 7-(аланин)таксола

К раствору 7-(ананил)таксола (62 мг, 0,0658 ммоль) в т-бутаноле (2 мл) и воде (1 мл), охлажденной до 0-5^оС, добавляли метансульфоновую кислоту (6,39 мг, 2,13 мл, 3 мг/мл) и полученную смесь размешивали при этой температуре в течение 2 мин, после чего смесь фильтровали через миллипористый фильтр (0,2 мкмоль). Фильтрат осушали вымораживанием и получали 66 мг продукта. Т.пл. 180-184^оС.

Физические свойства. Мол.м. 1021 Т.пл. 180-184^оС (разл.) Растворимость > 2 мг/мл

Рабочие условия ВЭЖХ Колонка RP-8, 150 мм (длина),

4,6 мм (внутр. диаметр) Подвижная фаза 0,02 М смеси ацетата

(рН 5) и ацетонитрила

(50:50), содержащей

0,001 М бисульфата

тетрабутиламмония Детектор Kratos Spectroflow Скорость потока 1 мл/мин Время удержива- ния 8,7 мл 7,3 таксол Стабильность плазмы 37^оС Условия t_1/2, ч Плазма человека 20 мкг/мл 11,9

П р и м е р 6. Получение 2-(аланин)таксола

а) Синтез 2" (CBZ-L-аланинил)таксола

К раствору таксола (30 мг, 0,0036 ммоль) и CBZ.L. аланина (8,5 мг, 0,036 ммоль) в метиленхлориде (5 мл) добавляли DCC (45 мг) и 4-диметиламинопиридин (4 мг), и полученную смесь перемешивали в течение 3 дней при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали, а растворитель удаляли из фильтрата. Остаток очищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем и проявляли в смеси этилацетата и петролейного эфира (1:1), слой выше таксола отделяли и элюировали этилацетатом, после чего растворитель удаляли и получали 28 г 2"-(CBZ аланил)таксола.

b) Синтез 2"(аланил)таксола путем разблокирования 2"(CBZ L-аланил)таксола.

2"(CBZ-L-аланил)таксол растворяли в этаноле в присутствии органической кислоты, такой, как муравьиная кислота, и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в присутствии 5% палладированного угля. Реакционную смесь фильтровали с целью удаления катализатора, а затем удаляли растворитель. Сырой продукт растворяли в этаноле и добавляли петролейный эфир, в результате чего получали 2-(аланил)таксол в виде формата или ацетата с низким до умеренного выходом.

П р и м е р 7. Получение 2"-(лизил)таксола

а) Синтез 2"(N-ди-t-ВОС-лизил)таксола

К смеси таксола (30 мг, 0,035 ммоль) и N-ди-t-ВОС-1-лизина (19 мг, 0,0368 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) добавляли DCC (100 мг) и 4-диметиламинопириден (10 мг) и перемешивали в течение 2 дней при комнатной температуре. После чего смесь фильтровали, а растворитель удаляли. Остаток очищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем и проявляли в смеси ацетата и петролейного эфира (1:1), слой выше таксола отделяли и элюировали этилацетатом, затем растворитель удаляли и получили 20 мг продукта.

в) Синтез 2"-(лизил)таксола путем разблокирования t-BOC-группы

Производное таксола N-t-BOC-защищенной аминокислоты подвергали взаимодействию с муравьиной кислотой (99% sigma), в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Избыток муравьиной кислоты удаляли путем выпаривания в присутствии азота. Полученный продукт очищали путем кристаллизации или хроматографии, в результате чего получали производное таксола N-разблокированной аминокислоты, в виде формата (соли).

П р и м е р 8. Получение 2"-(L-аланил)таксола

а) Синтез 2"-(FMOC-L-аланил)таксола

К раствору таксола (60 мг, 0,072 моль) и N-FMOV-L-аланина (22,4 мг) в метиленхлориде (6 мл), добавляли DCC (60 мг) и 4-диметиламинопириден (2 мг), после чего смесь перемешивали в течение двух дней при комнатной температуре и фильтровали. Растворитель удаляли из фильтрата. Полученный продукт очищали с помощью препаративной ТСХ на тарелках с силанизированным силикагелем и проявляли в смеси этилацетата и петролейного эфира (1:2). Слой выше таксола отделяли, растворитель удаляли и получали 48 мг продукта, содержащего 2"(FMOC-L-аланил)таксол. Т.пл. 162-164^оС (разл.).

в) Разблокирование FMOC-группы защищенного аминокислотного производного таксола

N-FMOC-защищенное аминокислотное производное таксола подвергали реакции взаимодействия с пиперидином в метиленхлориде в течение 2 ч, после чего растворитель удаляли. Остаток очищали с помощью хроматографии, в результате чего получали разблокированное аминокислотное производное таксола.

Фармацевтические композиции.

Предлагаемые соединения могут быть входить в состав фармацевтических композиций в чистом виде, или в виде их фармацевтически приемлемых солей, в частности, в виде нетоксичных фармацевтически приемлемых кислых аддитивных солей или приемлемых основных солей. Эти соли могут быть получены из соединений настоящего изобретения в соответствии со стандартной химической технологией.

Как правило, соли получают при помощи реакции свободного основания или кислоты со стехиометрическими количествами или с избыточными количествами нужных солей, образующих органическую или неорганическую кислоту в соответствующем растворителе или в комбинации растворителей. Например, свободное основание можно растворить в водном растворе соответствующей кислоты и выделить соль с помощью стандартной технологии, такой, как выпаривание раствора. Альтернативно, свободное основание можно растворять в органическом растворителе, таком, как низший алканол, простой эфир, алкиловый сложный эфир, или их смеси, например, метаноле, этаноле, простом эфире, этилацетате, растворе этилацетата и эфира и т.п. после чего раствор обрабатывают соответствующей кислотой с образованием соответствующей соли. Полученную соль выделяют с помощью стандартной техники, например, путем фильтрации целевой соли после самовыделения из раствора, или путем преципитации посредством добавления растворителя, в котором данная соль не растворяется, и ее последующего выделения.

Производные таксола настоящего изобретения могут быть использованы при лечении раковых заболеваний, благодаря их цитотоксичности и противоопухолевой активности. Новые соединения могут быть введены в виде таблеток, пилюль, порошковых смесей, капсул, инъецируемых растворов, суппозиториев, эмульсий, дисперсий, добавок в пищу и других подходящих форм. Фармацевтический препарат, содержащий предлагаемое соединение обычно смешивают с нетоксичным фармацевтическим органическим наполнителем или нетоксичным фармацевтическим неорганическим наполнителем в количестве приблизительно 0,01 мг/ 2500 мг, или выше, для разовой лекарственной формы, а предпочтительно, приблизительно 50-500 мг. Примерами фармацевтически приемлемых носителей могут служить: манит, мочевина, декстран, лактоза, картофельный или кукурузный крахмалы, стеарат магния, тальк, растительные масла, полиалкиленгликоли, этилцеллюлоза, поли (винилпирролидон), карбонат кальция, этилолеат, изопропилмиристат, бензилбензоат, карбонат натрия, желатин, карбонат калия, силиконовая кислота, и другие обычно используемые приемлемые носители. Фармацевтические препараты могут также содержать нетоксичные добавки, такие как эмульгирующие, предохраняющие, смачивающие агенты и другие, например монолаурат сорбитана, триэтаноламинолеат, полиоксиэтиленмоностеарат, глицеринтрипалмитат, сульфокцинат диоцилнатрия и т.п.

Стандартный способ получения препарата в виде таблетки, содержащей активный ингредиент, заключается в том, что сначала активные агенты смешивают с нетоксичным связующим, таким, как желатин, смола акации, этилцеллюлоза и т. п. Смешивание, как правило, осуществляют в стандартном V-смесителе и при условии безводной среды. Затем только что полученную смесь подвергают прессованию с помощью машины для таблетирования в таблетки. Свежеприготовленные таблетки могут быть покрыты оболочкой или оставлены непокрытыми. Характерными подходящими покрытиями являются нетоксичные покрытия, содержащие шеллак, воск карнаубы, сополимеры стирола и малеиновой кислоты и т.п. Для перорального введения, спрессованные таблетки, содержащие 0,01 мг, 5 мг, 25 мг, 50 мг, 500 мг и т.д. вплоть до 2500 мг, изготавливают в соответствии с представленным выше описанием при помощи стандартной техники, известной специалистам (см. Remington Pharmaceutical Science, Chapter 39, Mack Publishing Co. 1965).

Для изготовления таблеток активное соединение, кукурузный крахмал, лактозу, дикальцийфосфат, карбонат кальция обычно смешивают в условиях безводной среды и с помощью V-смесителя до тех пор, пока не получат однородную смесь. Затем приготавливают пасту из кукурузного крахмала в виде 10% пасты, и только что полученную смесь смешивают с этой пастой до тех пор, пока не получат однородную смесь. Затем эту смесь пропускают через стандартное мелкое сито, высушивают в безводной атмосфере и затем смешивают со стеаратом кальция, после чего смесь опрессовывают в таблетки, и по желанию покрывают оболочкой. Аналогичным способом изготавливают таблетки, содержащие 10, 50, 100 и 150 мг активного вещества.

Ниже приводится пример изготовления препаратов, содержащих предлагаемое соединение в виде таблеток.

Препарат I

Ингредиенты, мг/табл. Активное соединение 50,0 Кукурузный крахмал 15,0 Паста из кукурузного крахмала 4,0 Карбонат кальция 15,0 Лактоза 67,0 Стеарат кальция 2,0 Дикальцийфосфат 50,0

Изготовление капсул, содержащих 10 мг 2500 мг предлагаемого соединения для перорального введения, заключается в том, что указанное активное соединение смешивают с нетоксичным носителем и полученную смесь вводят в полимерную оболочку, обычно желатиновую или подобную ей. Как известно, капсулы могут иметь мягкую форму и изготавливаются путем включения соединения в тщательно размешанные дисперсионные смеси вместе с пищевыми совместимыми носителями, или указанные капсулы могут жесткую форму, которые, в основном, содержат соединение изобретения, смешанное с нетоксичными твердыми носителями, такими, как тальк, стеарат кальция, карбонат кальция и т.п. Примером капсул, содержащих 25 мг, 75 мг, 125 мг и т.д. нового соединения в чистом виде или в виде смесей одного или нескольких новых соединений, может служить приведенный ниже препарат II.

Препарат II

Ингредиенты, мг/капсула: Активный ингредиент 50,0 Карбонат кальция 100,0 Лактоза, U.S.R. 200,0 Крахмал 130,0 Стеарат магния 4,5

Указанные выше ингредиенты смешивают в стандартном смесителе и полученной смесью наполняют коммерчески доступные капсулы. Чем выше концентрация активного компонента, тем меньшее количество лактозы должно использоваться в данном составе.

Соединения изобретения могут быть осушены вымораживанием, и если необходимо, могут быть объединены с другими фармацевтически приемлемыми наполнителями, обычно используемыми при составлении композиций, предназначенных для парентерального введения путем инъекции. Для такого введения композиции могут быть разведены в воде (нормальной или соленой) или в смеси воды и органического растворителя, такого, как пропиленгликоль, этанол и т.п.

Вводимая доза может быть в виде одноразовой или разделенной дозы и варьироваться в зависимости от конкретного соединения, используемого в каждом конкретном случае, способа введения, веса пациента и его физического состояния. Вводимая доза не является строго определенным параметром, однако, как правило, указанная доза представляет собой эффективное количество или эквивалентное (на молярной основе) количество фармакологически активной свободной формы, продуцируемой из лекарственного препарата в результате метаболического высвобождения активного лекарственного средства в целях достижения желаемого фармакологического или физиологического эффекта. Обычно вводимая доза составляет порядка 0,8-8 мг/кг веса тела или около 50-275 мг/м²поверхности тела пациента, а предпочтительно около 230-275 мг/м².

Биологическая активность.

Как указывалось выше, предлагаемые производные таксола являются ценными лекарственными средствами вследствие их противоопухолевой активности. В частности, указанные соединения могут быть использованы при лечении некоторых видов рака, например опухолей легких, меланомы, лейкемии, опухолей молочной железы и рака прямой кишки.

Биологическую активность указанных производных таксола испытывали посредством (А) in vitro исследований и измерения кинетики скопления микротрубок; (В) in vitro исследований трансплантата МХ-1, привитого на подпочечную капсулу SRC.

А. Исследование кинетики скопления миркотрубочек in vitro

Микротрубочки являются неотделимой частью укариотических клеток, а комплексы микротрубочек играют важную роль в делении и размножении клеток. Известно, что полимеризация микротрубочек весьма восприимчива к кальцию, который обладает способностью к ингибированию скопления турбулина и деполимеризации уже скопившихся микротрубочек. Известные противоопухолевые соединения были исследованы на их влияние на скопления микротрубочек.

Винкаалкалоиды, такие, как винбластин и винкристин, способствовали разрушению клеточных микротрубочек, т.е. in vitro они показали способность к ингибированию скопления микротрубочек и к деполимеризации микротрубочек в устойчивом состоянии.

Аналогично, колхицин также показал способность к деполимиризации микротрубочек в клетках.

С другой стороны, обнаружилось, что таксол имеет совершенно уникальный механизм воздействия, который заключается в том, что он стимулирует скопление микротрубочек, но ингибирует их разъединение, препятствуя тем самым G₂ и М-фазам клеточных циклов и делению клеток. Исследования in vitro показали, что микротрубочки, уже полимеризованные, в присутствии таксола становятся устойчивыми к деполимеризации, вызываемой другими агентами, такими, как CaC_l2 или низкими температурами, которые обычно способствуют деполимеризации микротрубочек.

Авторы настоящей заявки проводили исследование влияния производных таксола на скопление микротрубочек. Это исследование проводили с использованием 2"- и 7-производных в соответствии с процедурами in vitro (см. Mellado et al. Biochemical and Biophysical Research Communication, vol. 124, N 2, 1984, pp. 329-336; Magri et al. J. Org. Chem. 51, 797-802, 1986; и Parness et al. Biochemical and Biophysical Research Communication, vol, 105, N 3, pp. 1082-1091, 1982). Способность указанных соединений к стимулированию скопления микротрубочек можно проследить следующим образом: таксол > 7-(N,N-диметиглицил)таксол (II) > 2" (N, N-диэтиламинопропионил)таксол (8)> >2"(N, N-диметилглицил)таксол (2). Указанное исследование показало, что свободная 2"-гидроксильная группа играет главную роль в скоплении микротрубочек. 2"-производные были активными только в том случае, если 2"-гидроксильная группа оставалась свободной на протяжении всей процедуры эксперимента. 7-производные имеют свободную 2"-гидроксильную группу и, следовательно, являются активными. Полученный результат находится в хорошем согласии с результатами активностей 2"- и 7-ацетил таксола (см. et al. Biochemical and Biophysical Research Communication, vol. 124, 1984, рр. 324-336).

В. In vitro-исследование культуры клеток В16.

Для подтверждения активности предлагаемых производных таксола были проведены исследования in vitro культуры клеток меланомы В-16. Указанные исследования проводили в соответствии с стандартными процедурами (см. Himes, lancer Biochem. Biophys. vol.7. 1984, p.133).

При исследовании пролиферации клеток меланомы В-16 были установлены эффективности в следующем порядке возрастания: таксол > 2"-(N,N-диметиглицил)таксол > 2 -(N, N-диэтиламинопропионил)таксол > 7-(N,N-диметилглицил)таксол. Эти исследования и исследования другой кинетики показали, что активность 2"-производных обусловлена таксолом. По всей вероятности, 2"-производные действуют в качестве пролекарственного средства. Однако 7-производные обладают своей собственной активностью и, очевидно, не являются пролекарственным средством.

С. Исследования in vivo.

Третий тип эксперимента, проведенный для подтверждения биологической активности производных таксола, заключался в исследовании in vivo, которое осуществляли путем введения в подпочечную капсулу мыши трансплантата человеческой карциномы молочной железы МХ-1. Испытания проводили с помощью известной методики (см. NLH Publication N 84-2635, In vivo lancer Model. 1984, с. 23-24).

Процедура.

В описываемой процедуре использовали тестируемые группы животных (6 мышей в каждой группе) и контрольные группы (12 мышей в каждой группе). Фрагмент опухоли (трансплантат человеческой карциномы молочной железы МХ-1) имплантировали в мембранную оболочку почки каждой мыши. Исследование проводили по следующей схеме:

День 0. Животных анастезировали. Фиксировали вес тела (вес дня 1). Имплантируемую опухоль измеряли и результаты фиксировали. После выхода из наркоза животных рандомизировали. Готовили серию бактериальных культур. Определяли растворимости агентов теста. Ежедневно регистрировали смертность.

День 1. Контролировали культуры. В случае контаминации культуры отбрасывали. Готовили материалы для теста. Начальные инъекции тестируемого агента (в загривок) определяли на основании веса тела. Обработка Q4D в день 1,5 и 9. Для каждого дня готовили свежую инъекцию тестируемого агента и вводили в соответствии с весом тела мыши на этот день.

День 2. Снова проверяли культуры. В случае контаминации тест прекращали и в соответствии с этим делали запись.

Дни 5 и 9. Для каждого дня готовили свежий тестируемый агент для инъекций, который вводили в соответствии с весом тела на этот день.

День 11. Эксперимент завершали и оценивали результаты. Вес тела регистрировали (веса дня 2). Опухоль измеряли в ОМед. (Окуляр-микрометр-единица 10 Омед 1 мм) и измерения регистрировали.

Оценка результатов.

Фиксировали изменение массы опухоли () на основании измеpений длины и ширины (мм). Средний вес животных подсчитывали для дня 1 и для дня 11, а также подсчитывали Т/С для всех тестируемых групп с > 65% выживания на день 11. Динамика изменения излишнего веса тела (тестируемый минус контрольный) может быть также использована при оценке токсичности. Размеры измеряли в ОМед. Компьютер использовали при следующих расчетах:

1. При переводе ОМед. в миллиметры (мм).

2. При подсчете веса опухоли (мг) на основании размеров опухоли мм х мм по формуле для объема вытянутого эллипсоида:

где L представляет более 2-х измерений.

3. При расчете изменения () среднего веса опухоли для каждой группы мышей:

Изменение среднего веса опухолиСредний вес опухоли конечный Средний вес опухоли начальный.

4. При расчете изменения () среднего веса опухоли для тестируемых (Т) и контрольных (С) групп.

5. При расчете Т/C (%) для всех тестируемых групп с процентом выживания более 65% на последний день эксперимента:

10елвспл

Критерии активности.

Значение начального Т/C 20% свидетельствует об умеренной активности. Репродуцируемое Т/С 10% свидетельствует о значительной активности.

Результаты испытаний, проведенных для нескольких производных таксола, представлены в табл.1 и 2.

Из этих результатов видно, что предлагаемые производные таксола показывают прекрасную противоопухолевую активность. Поэтому указанные соединения могут быть использованы в качестве противоопухолевого средства благодаря их хорошей биологической активности и более лучшей, по сравнению с таксолом, водорастворимостью.