акрилоилпроизводные таксола и способ их получения, водорастворимые производные таксола и способ их получения (варианты)

Формула изобретения

1. Акрилоилпроизводные таксола формулы I



2. Водорастворимые производные таксола общей формулы II



где R представляет группу -(СН_y)_n-CO-NH(CH₂)_Z-SO₂OM; -CH₂-CH₂-CO₂OM;

-(CH_y)_n-CO-O-(CH₂)_Z-OH, где M выбирают из группы, состоящей из водорода, щелочного металла, такого, как натрий и аммоний,

n 1 3,

y 1 2, при условии, что y 1, когда n 1, z 2 3.

3. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что M представляет натрий.

4. Соединения по п. 2, где y 2, n 2 и z 2.

5. Соединения по п. 2, где y 2, n 2 и z 3.

6. Соединения по п. 2, где M обозначает четвертичный аммоний.

7. Способ получения акрилоилпроизводных таксола формулы I, отличающийся тем, что осуществляют смешение акриловой кислоты с амином, таким, как триэтиламин, в растворителе, таком, как тетрагидрофуран в инертной атмосфере, охлаждение полученного раствора до примерно 0^oС, добавление к раствору активизирующего агента, такого, как изобутилхлорформат, и нагревание до примерно комнатной температуры, добавление таксола к полученному раствору.

8. Способ получения водорастворимого производного таксола общей формулы II, где R CH₂CH₂SO₂OM, M щелочной металл, отличающийся тем, что осуществляют растворение акрилоилпроизводного таксола формулы I в растворителе, таком, как изопропанол, и добавление к полученному раствору водного раствора бисульфита щелочного металла, такого, как мета-бисульфит.

9. Способ получения водорастворимого производного таксола общей формулы I, где R (CH_y)_n CONH(CH₂)_Z SO₂OM, где M, z, y и n имеют значения, указанные в п. 2, отличающийся тем, что осуществляют взаимодействие таксолового производного 2"-О-ациловой кислоты общей формулы



где R обозначает -(CH_y)_n CO-OH, где y 1 2, и n 1 3 при условии, что y 2, когда n 1, с соединением NH₂ - (CH₂)_Z SO₃ M, полученным путем взаимодействия соединений, имеющих формулу

NH₂(CH₂)_Z SO₃H,

с водным раствором соединения аммония для образования соли, и имеющего структурную формулу

NH₂ (CH₂)_Z SO₃M,

где z 2 3, M означает группу аммония,

и при желании превращают группу аммония в полученном соединении в группу, выбранную из водорода и щелочных металлов, таких, как натрий.

10. Способ получения водорастворимого производного таксола формулы II, где M, n, z, y имеют значения, указнные в п. 2, отличающийся тем, что проводят взаимодействие таксола с соединением общей формулы

NOOC (CH_y)_n -CO-NH-(CH₂)_Z SO₂O M,

где M группа аммония;

n 1 3;

y 1 2, при условии, что y 2, когда n 1;

z 2 3,

с образованием производного таксола общей формулы



где R означает -(CH_y)_n CO NH (CH₂)_Z - SO₂O M, где M группа аммония n 1 3, y 1 2, при условии что y 2, когда n 1 и z 2 3,

и, если желательно, в полученном соединении переводят группу аммония в группу, выбранную из группы, состоящей из водорода и щелочных металлов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к водорастворимым производным таксола с противоопухолевой активностью, а более конкретно, к сульфированным производным 2"-акрилоилтаксола, производным 2"-сульфоалкиламино-О-ацилкислого таксола и 2"-этилен-гликоль-О-ацеилкислого таксола.

Таксол это дитерпеноид природного происхождения, обладающий значительной противоопухолевой активностью, проявившей ее по отношению к опухолям различной природы. Впервые о выделении таксола и его структуре было сообщено Wani в "Противоопухолевые препараты растительного происхождения. IV Выделение и структура таксола. Новые противоопухолевые и противолейкемические препараты из Taxus brevifolia J.Am.Chem.Soc, 1971, 93, 2325. Таксол обнаружен в коре тиссового дерева. Taxus brevifolia так же, как и T.Baceata и T. сuspidata.

Биологическая активность таксола связана с его действием на процесс деления клеток. Таксол промотирует образование микроканальцев, образующих митотическое веретено в процессе клеточного деления. Однако таксол предотвращает деполимеризацию тубулина, образующего микроканальцы митотического веретена, которая оказывает существенное влияние на процесс клеточного деления. Таким образом, таксол служит причиной остановки клеточного деления. Механизм действия таксола обладает особенностью, связанной с тем, что он промотирует образование полимеров тубулина, в то время как другие противоопухолевые препараты, такие как винбластин и колцихин, предотвращают образование микроканальцев.

Обширное обследование таксола не было осуществлено, поскольку таксол выделен лишь в небольших количествах и до сих пор еще не существует успешного пути синтеза таксола. Предварительные исследования показали, что таксол может обладать маргинальной активностью при острых лейкемиях и меланомах, и некоторая активность наблюдалась в случае некоторых других опухолей. Далее исследования Mc Juire и других показали, что таксол должен быть активным в отношении рака яичников, не поддающегося лечению лекарственными препаратами. См. "Таксол": Уникальное противоопухолевое средство, эффективно действующее на прогрессирующие овариальные эпителиальные новообразования", Ann. Int. Med. 1989, 111, 273-279, обозначенное здесь как ссылка. Однако из-за низкой растворимости таксола в воде, его вводят путем инфузий, разбавляя водными растворами декстрозы.

Следует отметить, что в фазе I клинических испытаний таксол сам не оказывает повышенного токсического действия, но тяжелые аллергические реакции были вызваны эмульгаторами, вводимыми вместе с таксолом для того, чтобы компенсировать низкую растворимость таксола в воде. Действительно, по крайней мере один смертный случай был вызван аллергической реакцией, индуцированной эмульгаторами. В связи с этим исследователи предприняли попытку создать водорастворимые производные таксола, которые бы сохраняли свою противоопухолевую и противораковую активность.

Приведенная на чертеже структура таксола охарактеризована данными ¹Н ЯМР спектра образца таксола. Сигналы ЯМР спектра хорошо различимы и перекрывают область от 1,0 до 8,2 м.д. Для простоты спектр разделен на три области: первый диапазон от 1,0 до 2,5 м.д. включает интенсивные 3-протонные сигналы метильных и ацетатных групп, а также сложные мультиплеты, вызванные некоторыми метиленовыми группировками; второй диапазон от 2,5 до 7,0 м.д. включает сигналы протонов таксонового скелета и боковой цепи, а третий диапазон от 7,0 до 8,2 м.д. включает сигналы ароматических протонов С-2 бензоата, С-3-фенильной и С-3-бензамидной групп. Пики ЯМР спектра на чертеже отмечены в соответствии с номером углеродного атома в структуре таксола, с которым связаны протоны, дающие сигналы.

Magri и Kingstеn сообщили о биологической активности таксолов, замещенных в положении С-2 и С-7, которые были синтезированы для того, чтобы увеличить растворимость в воде. См. "Модифицированные таксолы. Синтез и биологическая активность таксолов, модифицированных в боковой цепи", Journal of Natural Products 51, N 2, стр.298-306, март-апрель 1988, работа, включенная как ссылка. Был синтезирован 2"-(трет-бутилдиметилсилил)таксол и было установлено, что это производное по существу неактивно; это привело к мысли о том, что биологическая активность проявляется у тех производных таксола, у которых в положении 2"-боковой цепи таксола находится свободная гидроксильная группа. Далее ацильные заместители в положении 2" и 2"-ацетилтаксоле и 2", 7-диацетилтаксоле легко гидролизовались в условиях in vivo, и оба эти соединения проявили активность в биоисследовании на клеточной культуре. Лабильность ацильных заместителей в 2"-положении навела на мысль о том, что 2"-ацетилтаксолы могут служить в качестве пролекарственных форм таксола. (Как правило, пролекарственная форма это соединение, которое проявляет фармако- логическую активность после биотрансформации).

Magri и Kingsten сообщили, что два таксола с повышенной растворимостью в воде были получены ими: 2"-(-аланил)таксол:

O и 2"-сукцинилтаксол:

Ph O

Было установлено, что 2"-(-аланил)таксол активен как in vivo, так и in vitro, но само соединение не стабильно. 2"-сукцинилтаксол, полученный путем обработки таксола ангидридом янтарной кислоты, обладает меньшей Р-238 активностью in vivo в сравнении с таксолом. В результате попытки исследователей были сосредоточены на создании других производных таксола, которые бы не страдали от нестабильности и были бы активны как in vitro, так и in vivo. Deuteh и другие в работе "Синтез родственных соединений и пролекарственных форм. 3¹. Водорастворимые пролекарственные формы таксола, обладающие значительной противоопухолевой активностью", I.Med.Chem, 1989, 32, 788-792, на которую здесь ссылаются, сообщили, что соли 2"-сукцинилтаксола и 2"-глутарилтаксола обладают повышенной противоопухолевой активностью в сравнении со свободными кислотами. Поскольку этими исследователями было выдвинуто предположение о том, что соли, содержащие различные противоионы зачастую отличаются по своим свойствам, то было синтезировано и проверено множество 2"-замещенных солей таксола. Установлено, что соли производных 2"-замещенного таксола с триэтаноламином и N-метилглюкамином обладают лучшей растворимостью в воде и повышенной активностью в сравнении с натриевыми солями. Было установлено, что ряд солей 2"-глутарилтаксола обладают повышенной активностью в сравнении с аналогичными соединениями 2"-сукцинилтаксола. В частности, хорошую растворимость и биоактивность продемонстрировала соль таксола, полученная при взаимодействии 2"-глутарилтаксола с 3-(диметиламино)-1-пропиламином, с использованием N,N-карбонил- диимидазола (КДИ).

Кроме того, для увеличения растворимости и биоактивности таксола необходимо, чтобы производные таксола обладали повышенной стабильностью для продления срока их хранения. Полагают, что соли эфиров таксола легко гидролизуются в присутствии основания и водорастворимые группы, такие как соли карбоновых кислот или соли аминов, обладают склонностью к превращению в основную форму. Итак, желательно синтезировать нейтральные, водорастворимые производные таксола, активность которых была бы выше или сравнима с активностью самого таксола. Соли органических сульфонатов склонны к образованию нейтральной или слабоосновной среды, и поэтому, сульфонатные соли эфиров таксола должны обладать повышенной стабильностью. В связи с трудностями синтеза солей карбоновых кислот и солей аминов эфиров таксола желательно было найти менее дорогие водорастворимые производные таксола и способ их получения.

Изобретение относится к получению водорастворимых производных таксола и водорастворимых сульфонатных солей таксола. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, 2"-[(3-сульфо-1-оксопропил)-окси]таксола натриевая соль получена при взаимодействии таксола с акриловой кислотой, при этом полученный 2"-акрилоилтаксол далее вступает в реакцию Михаэлиса с бисульфитом натрия, образуя соль 2-сульфоэтилового эфира таксола. Другой предпочтительный вариант включает взаимодействие солей аминосульфокислот с янтарным или глутаровым ангидридом с последующим взаимодействием полученного продукта с таксолом с образованием производных сульфоалкиламина 2"-О-ацил- кислого таксола. Еще в одном способе осуществления изобретения получены этиленгликолевые производные 2"-О-ацилкислых таксолов. Эти соединения отличаются высокой растворимостью в воде и демонстрируют противолейкемическую, противоопухо- левую и/или противораковую активность.

Итак, первоочередная цель изобретения это получение водорастворимых производных таксола, обладающих высокой биоактивностью и стабильностью.

Следующая цель изобретения это создание простого и недорогого способа получения 2"-акрилоилтаксолов и солей их сульфопроизводных.

Еще одна цель это получение 2"-О-ацил-кислых таксолов и их солей с сульфоалкиламинами.

Кроме того, имеется и цель, заключающаяся в создании простого и недорогого способа получения сульфоалкиламиновых производных 2"-О-ацилкислых таксолов.

Дальнейшая цель изобретения состоит в получении гидроксилалкилокси производных 2"-О-ацилкислого таксола.

На чертеже представлена структура таксола и его ЯМР-спектр, пики на котором отмечены в соответствии с теми частями структуры таксола, к которым они относятся.

Таксол был получен в Национальном Раковом Институте, ¹Н ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры были сняты на спектрометре Брукера марки 270 SY 270 МГц; 2D-ЯМР спектры были получены на спектрометре Брукера WP 200 на 200 МГц. Химические сдвиги все записаны в м. д. относительно тетраметилсилана (TMC) в случае ¹Н-ЯМР, а в случае ¹³С-ЯМР химические сдвиги относительно сдвига хлороформа при 77,0 м.д. или относительно ТМС при 0 м.д. Спектры образцов, как правило, записывали в растворе CDCl₃ или CD₃OD при комнатной температуре. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре, связанном с газовым хроматографом (хромасс) марки Finnegan-МАТ 112 и масс-спектрометре марки 7070, оборудованном датчиком, ПАБ-источником и EI/Cl источником. ЯМР и масс-спектрометрические данные весьма полезны в исследовании таксола и его производных наряду с данными других методов, таких как ИК и УФ-спектроскопия, обеспечивающих дополнительную информацию о конформационной структуре.

Для снятия ИК-спектров, а также УФ-спектров были использованы спектрофометры фирмы марки Perkin-Elmer 710В и Perkin-Elmer ВЭЖХ (высокоэффективная газожидкостная хроматография) образцов осуществлялась на аппаратуре, в состав которой входят насос марки Watess M 6000, c Ricodyne инжекторным клапаном, колонкой Watess Radial Pak RL M-100 RP-8 и УФ детектором марки Watess 440.

2"-Акрилоилтаксолы.

Натриевая соль 2"[(-3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола была получена при взаимодействии таксола с акриловой кислотой с последующим проведением реакции Михаэлиса с добавлением бисульфит-иона. Реакцию сочетания таксола с акриловой кислотой проводили в присутствии изобутилхлороформиата. После очистки с использованием флеш-хроматографии (силикагель, элюент дихлорметан этилацетат 1: 1) получили 2"-акрилоилтаксол с 94% выходом. Используя метод тонкослойной хроматографии установили, что реакция сочетания акриловой кислоты с таксолом проходит на 90% за 15 ч при 60^оС. Дизамещенные C"-2, С-7 продукты не образуются после продленного времени реакции, Н-ЯМР спектр 2"-акрилоилтаксола, показал, что сигнал C"-2 протона сдвинут до 5,46 м.д. (d, j 3) от 4,73 м.д. для протонов C"-2 незамещенного таксола. Сдвиг протонов вызван ацилированием С-2"гидроксильной группы. Поскольку сигнал для С-7 протонов при 4,43 м.д. остался практически без изменения в сравнении с С-7 протонами незамещенного таксола, сигнал которых находится при 4,38 м.д. то сделан вывод о том, что реакция в положении С-7 не происходит. Масс-спектроскопия показала молекулярную массу 907 с пиками при м/з 930 (MNa⁺) и 908 (МН⁺).

Затем 2"-акрилоилтаксол запускают в реакцию Михаэлиса с бисульфитом натрия. Бисульфит натрия используют потому, что он представляет собой хороший нуклеофил, и потому, что он создает подходящее для реакции значение рН. ЯМР спектр протонов продукта реакции присоединения Михаэлиса отличался от ЯМР спектра 2"-акрилоилтаксола. В спектре продукта присоединения Михаэлиса отсутствуют сигналы виниловых протонов, характерных для спектра 2"-акрилоилтаксола. Однако наличие двух триплетов 3,14 м.д. и 2,93 м.д. указывает на появление двух новых метиленовых групп в продукте присоединения Михаэлиса. Масс-спектроскопия свидетельствует о молекулярной массе 1011 с пиками при м/з 1034 (MNa⁺) и 1012 (МН⁺).

Была предпринята попытка получения натриевой соли 2"-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси] таксола в одностадийном процессе путем сочетания таксола с 3-гидрокси-3-оксопропилсульфокислотой в присутствии пиридина и дициклогексилкарбодиимида (ДЦК), но продукт не был получен. Это возможно связано с тем, что сульфонильная группа атакует промежуточный продукт реакции.

Производные 2"-О-ацил-кислого таксола.

Натриевая соль 2"-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]-окси}таксола и натриевая соль 2"-{[4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола были получены с высокими выходами при взаимодействии 2"-сукцинилтаксола с 2-аминоэтилсульфокислотой (таурином) и, соответственно, с солью тетрабутиламмония и 3-аминопропилсульфокислоты. Отметим, что для того, чтобы сделать аминоалкилсульфокислоты растворимыми в органических растворителях, можно использовать любые соли четвертичного аммония, 2"-сукцинилтаксол получают в результате взаимодействия ангидрида янтарной кислоты с таксолом, осуществляемого при комнатной температуре в течение 2 ч в пиридине или ДМП. Сравнение ЯМР-спектров таксола и 2"-сукцинилтаксола показывает наличие сдвига С-2 протонов к 5,51 м.д. а сукцинильные протоны дают мультиплетный сигнал с центром примерно при 2,6 м.д.

Затем 2"-сукцинилтаксол запускают в реакцию с солью тетрабутиламмония и таурина в присутствии агента сочетания изобутилхлорформиата. После выделения с использованием флеш-хроматографиии (силикагель, элюент дихлорметан этанол 7: 1) получают со 100% выходом соль 2"-{[4-(2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] ок- си}таксола и тетрабутиламмония. За 2 ч, как показывает мониторинг с использованием ТСХ, реакция завершается только на 80% Для 100% выхода нужно продлить время реакции. На ЯМР-спектре сульфоалкиламин-производного 2"-сукцинилтаксола имеется два новых пика при 3,6 м.д. и 2,94 м.д. характерных для двух метиленовых групп. Натриевую соль 2"-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] окси} таксола получили, пропустив соль тетрабутиламмония и 2"-{ [4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] ок- си}таксола через ионно-обменную колонку Dowex 50 (Na⁺ форма). В ЯМР-спектре натриевой соли отсутствуют сигналы, характерные для бутильной группы. Масс-спектроскопия свидетельствует о мол.м. 1082 в присутствии пиков м/з 1105 (MNа⁺) и 1083 (МН⁺).

Натриевая соль 2"-{ [4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]-окси} таксола была получена согласно той же методике, по которой была получена натриевая соль сульфоэтиламинотаксола; однако вместо таурина была использована соль тетрабутил- аммония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты. ЯМР-спектр подтвердил образование 3-сульфопропиламинопроизводного; новые пики при 3,28 м. д. 1,98 м.д. и 2,87 м.д. представляют три дополнительные метиленовые группы, образующие пропильную группировку. Натриевая соль, образуемая производный сульфопропиламино-сукцинил таксола была получена в результате пропускания соли тетрабутиламмония через ионообменную колонку с Dowex 50 (Na⁺ форма). Масс-спектроскопия натриевой соли сульфопропиламиносукцинилтаксола показала молекулярную массу 1096 в присутствии пиков при м/з 1119 (MNa⁺) и 1097 (МН⁺).

Также предполагается, что между аминосульфокислотой и ангидридом или двуосновной кислотой может быть образована амидная связь и что полученный продукт может взаимодействовать с таксолом с образованием водорастворимых производных 2"-О-ацилкислого таксола. Предпочтительно, когда аминосульфокислота представлена в виде растворимой в органическом растворителе соли.

Попытки синтезировать натриевую соль 2"{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобу- тил] окси} таксола непосредственно из 2"-сукцинилтаксола в одну стадию оказались безуспешны. 2"-Сукцинилтаксол соединили с триэтаноламином, изобутилхлорформиатом, тетрагидрофураном (ТГФ), таурином, ДМФ и водой. Однако вода, необходимая для солюбилизации таурина, вызывала гидролиз смешанного промежуточного ангидрида и, в результате образовывались исходные вещества. В тех случаях, когда были использованы неводные условия, реакция также не шла, поскольку таурин не растворялся в органических растворителях.

Путем соединения 2-сукцинилтаксола, триэтиламина, изобутилхлороформиата, ТГФ, 2-тиоэтиламина и дихлорметана был получен 2"-{[4-((2-этантиол)амино)-1,4-диоксобутил] окси} таксол с низким выходом. Попытка окислить тиол в желаемую сульфокислоту в присутствии мета-хлоропербензойной кислоты (МХПЕК) и дихлорметана не привела к образованию заметного количества требуемого производного сульфоалкиламиносукцинилтаксола.

Этиленгликолевые производные сукцинилтаксола.

2"-{ [4-((Гидроксиэтил)окси)-1,4-диоксо- бутил] окси}таксол был получен при взаимодействии сукцинилтаксола с этиленгликолем. Производное гидроксиэтилокси- сукцинилтаксола было получено с 83% выходом через 20 ч выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре. Производное гидроксиэтилоксисукцинилтаксола было синтезировано для того, чтобы превратить вторичную гидроксильную группу в положении 2"- в таксоле в первичную гидроксильную группу. Предполагается, что гидроксильная группа в продукте более реакционноспособна нежели гидроксильная группа в таксоле, а это дает возможность получения других производных таксола в мягких условиях. ЯМР-спектр этиленгликолевого производного свидетельствует о наличии новых пиков при 3,7 м. д. и 2,1 м.д. относящихся к двум новым метиленовым группам гидроксиэтилокси производного. Масс-спектроскопия дала молекулярную массу 997 при пиках с м/з 1020 (MNа⁺) и 998 (МН⁺).

Формиат 2"--аминобутирилтаксола.

Формиат 2"--аминобутирилтаксола был синтезирован путем смешения таксола с N-карбобензилокси(CBZ)--аминомасляной кислотой с последующим отщеплением защитной группы от амина. Таксол реагирует с N-CBZ--аминомасляной кислотой в присутствии дициклогексилкарбодимида (ДЦК), используемого как агента реакции сочетания. После очистки методом препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле с элюентом гексан этилацетат 3:2 был получен с 75% выходом 2"-N-CBZ- -аминобутирилтаксол. При добавлении воды ДЦК разлагается с образованием дициклогексилмочевины так, что удалить избыток реагентов, используемых для проведения реакции, не представляет проблемы. Большая часть дициклогексилмочевины и N-CBZ--аминомасляной кислоты удалялась путем фильтрации. Удаление защитной группы 2"-N-CBZ--аминобутирилтаксола проводили, использовав в качестве источника водорода муравьиную кислоту и 5% Pd/C в качестве катализатора. Муравьиная кислота обеспечивает активную форму водорода для удаления CBZ защитной группы, а также приводит к образованию соли формиата производного 2"--аминобутирилтаксола, которая более растворима в воде нежели нейтральная форма. ЯМР-спектр подтверждает образование формиата 2"--аминобутирилтаксола. Однако это соединение нестабильно в метанольном растворе и распадается через несколько часов с образованием таксола. Эта нестабильность привела к тому, что формиат 2"--аминобутирилтаксола далее не рассматривался в качестве пролекарственной формы таксола.

Растворимость в воде.

Растворимость в воде всех соединений определяли путем вычисления коэффициента распределения между октанолом-1 и водой. Для определения растворимости использовали октанол, насыщенный дистиллированной водой, и дистиллированную воду, насыщенную октанолом. Результаты проведения экспериментов по определению коэффициента распределения показали, что натриевая соль 2"-[3-сульфо- 1-оксо-пропил)окси]таксола в 210 раз более растворима в воде нежели сам таксол, натриевая соль 2"-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]окси} таксола в 191 раз более растворима в воде, чем таксол, и натриевая соль 2"-{ [-4-((3-сульфопропил)-амино)-1,4-диоксобутил] окси} таксол в 118 раз более растворима в воде, чем таксол.

Не ограничивающие изобретение примеры демонстрируют методы специфического синтеза водорастворимых производных таксола настоящего изобретения. Все технические и научные термины, использованные здесь, понятны любому специалисту в данной области. Другие методы и материалы, подобные или эквивалентные использованным, могут применяться в процессе получения или исследования соединений изобретения.

П р и м е р 1. В круглодонной колбе в атмосфере аргона растворили в 5 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ) 50 мл триэтиламина и 30 мл акриловой кислоты. После охлаждения раствора до 0^оС в ледяной бане к нему добавили 50 мл изобутилхлороформиата, и реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин. Затем в реакционной смеси добавили 100 мг таксола и реакционную смесь перемешивали в течение 15 ч при 60^оС, проверяя ход реакции методом ТСХ с элюентом дихлорметан этилацетат 2:1. В процессе реакции выпал в осадок гидрохлорид триэтиламина, который удаляли путем фильтрации. Растворитель отогнали в вакууме, и продукт очистили методом флеш-хроматографии, использовав силикагель и в качестве элюента дихлорметан этилацетат 1:1. Получили в результате 100 мг (94% выход) 2"-акрилоилтаксола:

O

Акрилоильная группировка 2"-акрилоилтаксола вследствие электрофильности -алкенового углеродного атома, являющегося местом нуклеофильной атаки, представляет хороший акцептор Михаэлиса. Таким образом взаимодействие 2"-акрилоилтаксола с подходящими нуклеофилами будет приводить к образованию продуктов присоединения Михаэлиса в положение 2"-таксола. В примерно 3 мл перегнанного изопропанола растворили 85 мг 2-акрилоилтаксола, а 84 мг метабисульфита натрия растворили в примерно 1 мл дистиллированной воды. Два раствора смешали вместе, и полученную реакционную смесь перемешивали при 60^оС в течение 15 ч. Мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ с использованием в качестве элюента дихлорметан метанол 10:1. Затем растворители отогнали в вакууме, а воду удалили в виде азеотропной смеси с ацетонитрилом. Для очистки продукта использовали флеш-хроматографию, применив в качестве элюента смесь дихлорметан изопропанол 2:1. В результате получили 83,5 мг (83,5% ) натриевой соли 2"-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола, формула которого представлена

Были сняты спектры ЯМР, УФ, ИК (KBr) масс-спектры образцов продукта, а также определены оптическое вращение и точка плавления продукта. Эти данные приведены в табл.1 и 2.

Предполагается, что использованная акриловая кислота может быть заменена другими представителями семейства акриловой кислоты, которые также являются хорошими акцепторами Михаэлиса, катионом может служить другой щелочной металл или аммонийная группа, такая как тетрабутиламмоний. Очевидно также, что солеобразующая группировка может быть замещена Н. Биологические исследования натриевой соли 2"-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола показали, что соединение в дополнение улучшенной растворимости обладает биоактивностью.

П р и м е р 2. В 25 мл колбе, снабженной магнитной мешалкой, соединили 206 мг таксола, 2,9 мг 4-диметиламинопиридина (ДМПА) и 49 мг ангидрида янтарной кислоты. К смеси добавили 2,0 мл сухого пиридина, и полученный раствор перемешивали в течение 2,5 ч при комнатной температуре. После этого добавили несколько миллилитров воды, при этом образовался белый осадок в непрозрачной суспензии. Для экстрагирования продуктов добавили несколько миллилитров дихлорметана. Добавление 1 мл концентрированной HCl вызывает исчезновение белой водной суспензии. Для осушения слоя дихлорметана использовали сульфат натрия, который затем отфильтровывают и упаривают. Тонкослойная хроматография с использованием в качестве элюента -СН₂С₂ MeOH 7:1 показала лишь следы оставшегося пиридина. Оставшийся пиридин удалили путем циклического добавления гептана с последующей отгонкой; в результате получили 218 мг сукцинилтаксола, что составляет 96,6% выход. ЯМР-спектр продукта соответствует данным, приведенным в литературе. Структура была также подтверждена с использованием 2D-ЯМР спектроскопии НОМО COSY (моноядерная корреляционная спектроскопия).

Таурин, H₂NCH₂CH₂SO₃H высокополярное соединение, в основном нерастворим в органических растворителях, таких как хлороформ. Производные таурина и органических кислот ранее получали путем обработки хлорангидрида кислоты таурином в условиях Шоттен-Баумана (т. е. в основном водном или водно-этанольном растворе). Этот метод неприемлем для таксола, поскольку он легко гидролизуется в основание, и таким образом распадается в условиях реакции. Для того, чтобы разрешить эту проблему, был разработан новый метод, который включал добавление таурина к гидроксилу тетрабутиламмония, с последующим удалением непрореаги- ровавших материалов и упариванием. Это приводит к образованию соли тетрабутиламмония и таурина вместо натриевой соли, использованной в прототипе. Соль тетрабутиламмония и таурина растворима в органических растворителях, таких как дихлорметан. Таким образом, 2-сукцинилтаксол в ТГФ и триэтиламине может вступать в реакцию с изобутилхлороформиатом и солью тетрабутиламмония и таурина с образованием соли тетрабутиламмония и тауринпроизводного таксола. Отметим, что промежуточный продукт представляет собой смешанный ангидрид, который гидролизуется в исходное соединение в присутствии воды.

Для растворения 250 мг таурина в колбе был использован минимальный объем дистиллированной воды и к этому раствору добавили 1 мл водного гидроксида тетрабутиламмония. Этот раствор перемешивали при комнатной температуре в течение часа, а затем упарили до сухости. Сухой продукт растворили примерно 15 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ), отфильтровали, и фильтрат упарили до сухости. Сухой продукт затем растворили в 2 мл сухого ТГФ.

Получение соли тетрабутиламмония и 2"-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобу- тил]окси}таксола.

Раствор 2"-сукцинилтаксола, полученный растворением 122 мг 2"-сукцинилтаксола в примерно 4 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ) и 50 мл триэтиламина, охладили до примерно 0^оС. Раствор затем соединили с 50 мл изобутилхлороформиата, реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин и добавили 0,5 мл раствора соли тетрабутиламмония и таурина в ТГФ (эквивалентно 91 мг соли тетрабутиламмония и таурина). Вслед за добавлением соли тетрабутиламмония и таурина реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов, мониторинг реакции осуществляли, используя ТСХ с применением в качестве элюента этилацетат метиловый спирт 2:1. Реакционную смесь затем отфильтровали, и растворители упарили. После очистки методом флеш-хроматографии на силикагеле (300 х 15 мм, элюент -CH₂Cl₂:MeOH 7: 1) получали 168 мг (100% выход) соли тетрабутиламмония и 2"-{[4-((2-сульфоэтил)-амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола.

Тетрабутиламмониевую соль превратили в натриевую соль, поместив 160 мг соли тетрабутиламмония в склянку, заполненную ионообменной смолой марки Dowex 50 в Na⁺ форме (примерно 3 мл смолы на 3 мл деионизованной воды). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 1,5 ч смесь затем пропустили через небольшую колонку со смолой, содержащей 2 мл смолы в Na⁺ форме, используя в качестве растворителя деионизованную воду.

Раствор превратили в азеотроп путем добавления ацетонитрила, в результате получили 122 мг натриевой соли 2"-{[4-((2-сульфоэтил)-амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола



Параметры, характеризующие это соединение, приведены в табл.3, а данные химических сдвигов ЯМР-спектра в табл.4.

Отметим, что соль тетрабутиламмония и таурина может с легкостью вступать в реакцию с другими 2"-О-ацилкислыми таксолами, например, 2"-глутарилтаксолом. 2"-Глутарилтаксол можно легко получить, взяв вместо ангидрида янтарной кислоты глутаровый ангидрид. Полагают, что другие члены ряда щавелевой кислоты и другие ангидриды могут взаимодействовать с таксолом примерно так же, как и описанные соединения. Отметим, что в некоторых случаях предпочтительнее использовать 2"-глутарилтаксол нежели другие 2"-О-ацилкислые таксолы. Предполагается, что группировка, образующая соль, может быть замещена на Н или любой щелочной или щелочно-земельный металл.

П р и м е р 3. К раствору 280 мг 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты в дистиллированной воде добавили 1 мл гидроксида тетрабутиламмония. Раствор перемешивали в течение 1 ч, а затем упарили до сухости. Продукты растворили в примерно 15 мл ТГФ и отфильтровали избыток 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты. Фильтрат упарили и вновь растворили в 2 мл сухого ТГФ для проведения последующих реакций. Приготовили раствор, содержащий 130 мг 2"-сукцинилтаксола и 50 мл триэтиламина в 4 мл сухого ТГФ и охладили его до 0^оС. Аликвоту изобутилхлороформиата в 50 мл добавили в реакционную смесь и полученный раствор нагрели до комнатной температуры примерно за 15 мин. Затем добавили 0,6 мл раствора соли тетрабутиламмония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты в ТГФ (эквивалентно 108 мг соли тетрабутиламмония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ, используя в качестве элюента этилацетат:метанол 4:1. Затем реакционный раствор отфильтровали и упарили, продукт реакции очистили методом флеш-хроматографии на силикагеле (300 мм х 15 мм), использовав в качестве элюента дихлорметан метанол 10:1. Выход 128 мг (71,2%) гомогенной соли тетрабутиламмония и таксола.

Соль тетрабутиламмония превратили в натриевую соль, поместив 120 мг соли тетрабутиламмония и 2"-{[4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола в склянку, заполненную ионообменной смолой Dowex 50 в Na⁺ форме (примерно 3 мл смолы на 3 мл деионизованной воды). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, а затем пропустили через колонку со смолой, содержащей примерно 2 мл смолы в Na⁺ форме, используя в качестве растворителя деионизованную воду. Раствор азеотропировали ацетонитрилом, получили в результате 84 мг (79,3%) натриевой соли 2"-{[4-((3-сульфопропил)-амино)-1,4-диоксобутил)]окси}таксола:



Данные, характеризующие этот препарат, представлены в табл.5, а химические сдвиги ЯМР-спектра в табл.6.

Отметим, что натрий может быть замещен на Н или щелочной металл, или щелочно-земельный металл, а также на аммонийные группы.

П р и м е р 4. В токе аргона приготовили раствор, содержащий 26 мг 2"-сукцинилтаксола и 20 мл триэтиламина в 2 мл сухого тетрагидрофурана. Полученный раствор охладили до 0^оС и добавили к нему 10 мл изобутилхлороформиата, после чего реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин. После стадии нагрева к раствору добавили 5 мл этиленгликоля, после чего реакционную смесь перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ, используя в качестве элюента дихлорметан этилацетат 1:1. Реакцию остановили, отфильтровав осадок и упарив растворитель. Сырой продукт очистили методом тонкослойной препаративной хроматографии (элюент дихлорметан этилацетат 1:3), в результате получили 25 мг (83,3%) 2"-{[4-((2-гидроксиэтил)окси)-1,4-диоксобутил]окси}таксола:

Данные, характеризующие препарат представлены в табл. 7, а химические сдвиги ЯМР- спектра в табл.8, которые приведены ниже.

П р и м е р 5. В 10 мл колбу поместили 20 мг таксола, 40 мг дициклогексилкарбодиимида и 20 мг N-карбобензил--аминомасляной кислоты. Реагенты растворили в 4 мл сухого ацетонитрила (сухой ацетонитрил получили пропустив ацетонитрил через активированный оксид алюминия). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 30 ч раствор отфильтровали, удалив выпавшую в осадок дициклогексилмочевину. Растворитель затем отогнали в вакууме, а сырые продукты разделили, использовав препаративную ТСХ (элюент гексан этилацетат 45: 55). В результате получили 19,1 мг (75,9%) чистого 2"-N-CBZ--аминобутирилтаксола.

Формиат 2--аминобутиpилтаксола синтезировали путем добавления 6 мг 2"-N-CBZ--аминобутирилтаксола к 1,5 мл метанола. К растворенному производному CBZ-таксола добавили 1 мл муравьиной кислоты для образования 40% раствора муравьиная кислота/метанол. Для проведения реакции к раствору добавили 5 мг 5% Pd/C и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 26 ч. Реакцию остановили, отфильтровав Pd/C и упарив в вакууме фильтрат. В результате получили формиат 2--аминобутирилтаксола:



Снятый через несколько часов протонный спектр ЯМР и данные тонкослойной хроматографии (элюент дихлорметан этилацетат метанол 2:1:0,02) показали, что 2- -аминобутирилтаксол разложился с образованием таксола.

П р и м е р 6. Растворимость таксола определяли, растворяя 1,6 мг таксола в 10 мл дистиллированной воды, насыщенной октанолом-1 в делительной воронке, после чего добавляли 10 мл октанола-1, насыщенного дистиллированной водой. Воронку встряхивали, а затем оставили стоять примерно в течение 30 мин до разделения водной и органической фаз. После этого провели определение поглощения в УФ-области спектра при 228 нм водного слоя и/или октанольного слоя, при измерении поглощения октанольного слоя его предварительно разбавили в 5 раз.

Следуя той же самой процедуре, которая представлена выше и, использовав 0,8 мг натриевой соли 2"-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола, 0,8 мг натриевой соли 2"-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] окси}таксола и 0,7 мл натриевой соли 2"-{[4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола, определили растворимость в воде этих соединений относительно таксола; полученные результаты представлены в табл.9.

Как видно из данных табл.9, наивысшей растворимостью обладает производное 2"-акрилоилтаксола, которая в 210 раз превышает растворимость собственно таксола. Отметим, что таурин производное 2"-сукцинилтаксола обладает значительно большей растворимостью в воде, чем производные 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты и 2"-сукцинилтаксола, однако растворимость обоих соединений более чем в 100 раз превышает растворимость таксола. Пониженная растворимость производного 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты и 2"-сукцинилтаксола возможно вызвана удлинением алкильной цепочки.

П р и м е р 7. Хотя из примера 1, приведенного выше, очевидно, что другие члены семейства акриловых кислот, такие как, но не ограничено, акриловая кислота, замещенная в альфа и/или бета положении алкенами, арилами, и циклические соединения могут взаимодействовать с таксолом, были получены дополнительные производные акриловой кислоты и таксола для того, чтобы окончательно доказать, что другие члены семейства акриловой кислоты могут взаимодействовать с таксолом таким же образом, как и акриловая кислота.

Таксол (22 мг) в высушенной колбе, промытой аргоном, обрабатывают при 0^оС 1 мл раствора, полученного из дициклогексилкарбодиимида (DCC, 39,9 мг), транс-коричной кислоты (16,0 мг) и сухого ацетонитрила (примерно 4,0 мл). Добавляют каталитическое количество диметиламинопиридина (DMAP), и реакцию контролируют при помощи тонкослойной хроматографии. Через 15 мин добавляют вторую порцию, равную 1 мл, реакционного раствора. Через примерно полчаса смесь нагревают при 25^оС и выдерживают в течение 1 ч. Получают 10,4 мг 2"-транс-циннамоилтаксола (выход примерно 65%). Спектр ЯМР 2"-транс-циннамоилтаксола представлен на рис.2.

П р и м е р 8. Таксол (23 мг) в сухой колбе, промытой аргоном, обрабатывают при 0^оС 1 мл раствора, полученного из 43 мг DCC, 10,0 мг кротоновой кислоты и 4 мл сухого ацитонитрила. Добавляют каталитическое количество диметиламинопиридина (DMAP), и реакцию контролируют при помощи ТСХ. Через 15 мин добавляют вторую порцию, равную 1 мл, реакционного раствора и через примерно полчаса смесь нагревают до 25^оС и выдерживают в течение часа.

Очистка и анализ подтвердили, что синтезирован 2"-транс-кротонил таксол (45% выход).

Таким образом, в изобретении описаны новые производные таксола с повышенной растворимостью в воде по сравнению с таксолами самими по себе, и которые стабильны в течение более длительного периода времени, чем определенные известные производные таксола, имеющие увеличенную растворимость в воде.

Эти соединения получают новыми способами, с получением в основном чистых соединений с высоким выходом. Характеристики и данные ЯМР подтверждают структуру и свойства производных таксола по изобретению. Помимо высокой водорастворимости и улучшенной стабильности эти соединения сохраняют свою биологическую активность и применимость в качестве антинеопластиков и исходного сырья для противолейкемических и противораковых лекарственных средств.

Рассматриваемые эквиваленты водорастворимых производных таксолов изобретения включают производные 2"-акрилоил и 2"-О-акриловой кислоты и таксола, которые имеют один или более заместителей в виде боковой цепи или кольца, замещенные нейтральной группой (т.е. замещенной группой, которая не изменяет значительно желаемые свойства производных таксола настоящего изобретения), такие как, но не ограниченно, замещения другой нейтральной части молекулы на -Н, -OH, -OR, -NR, -Ar, или 0.

На основании изложенного можно сделать вывод, что возможны многочисленные модификации и вариации изобретения. И, следовательно, изобретение можно использовать и другими путями, чем описано в заявке.

Итак, изобретение раскрывает новые производные таксола с повышенной растворимостью в воде по сравнению с собственно таксолом. Эти производные стабильны в течение длительного периода времени, и очистке от некоторых полученных ранее производных таксола с повышенной растворимостью в воде. Эти соединения получают согласно новым способам, которые характеризуются высокими выходами в основном чистых продуктов. Данные характеристик и ЯМР-спектры подтверждают структуру и свойства производных таксола настоящего изобретения. Кроме того, обладая повышенной растворимостью в воде и улучшенной стабильностью, эти соединения сохраняют биологическую активность и их можно использовать в качестве пролекарственных форм, обладающих противоопухолевой, противолейкемической и противораковой активностью.

Рассматриваемые варианты производных таксола, растворимых в воде, включают 2"-акрилоил и 2"-О-ацил-кислые производные таксола, которые имеют один или более заместителей в боковой цепи и/или в кольце, замещенных безразличной группой (т.е. группой, которая практически не влияет на требуемые свойства производных таксола настоящего изобретения), такой как -H, -OH, -OR, -NP, Ar, или 0, замещаемой на другую безразличную группу.