антитератогенное средство

Формула изобретения

1. АНТИТЕРАТОГЕННОЕ СРЕДСТВО, отличающееся тем, что оно представляет собой препарат биомассы Poliscias filicifolia, полученной методом культуры тканей.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой экстракт биомассы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к производству лекарственных препаратов из растительного сырья, и может быть использовано в качестве антитератогенного фармакологического средства, снижающего или предотвращающего риск аномалий развития, индуцированных токсическими воздействиями, в частности, алкогольной интоксикацией в период беременности.

Из общедоступных литературных источников неизвестны свидетельства целенаправленного поиска антитератогенных средств, хотя с осложнением экологических проблем наблюдается рост всевозможных аномалий развития, включая различные врожденные нарушения высшей нервной деятельности человека. Беспрецедентных пределов достигла частота врожденной патологии и ранней перинатальной гибели в нашей стране. В этой связи необходима разработка фармакологических средств антитератогенов, защищающих антенатальное (внутриутробное) развитие человека от тератогенноактивных факторов среды, в том числе производственных и бытовых вредностей.

Из литературы известны единичные свидетельства антитератогенного действия различных химических соединений. В частности, цистин и глютатион существенно снижают тератогенное действие такого алкилирующего соединения как циклофосфамид.

Однако цистин предотвращает преимущественно аномалии конечностей, тогда как уродства развития центральной нервной системы (ЦНС) сохранялись. Глютатион предотвращал как уродства конечностей, так и аномалии ЦНС, однако его защитное действие эффективно проявлялось только при высоких дозах глютатиона 400 мг/кг, что в принципе исключает возможность его использования в качестве антитератогенного средства для лечения человека.

Известно также использование селенита натрия, который является более эффективным, чем цистин и глютатион антитератогеном по отношению к тому же модельному тератогену циклофосфамиду.

Селенит натрия также эффективно предотвращает тератогенное действие солей некоторых тяжелых металлов. Являясь незаменимым микроэлементом, селен действительно необходим в качестве протективного средства против ряда тератогенных воздействий, в силу чего необходимо адекватное содержание этого микроэлемента в рационе беременных женщин.

Однако использование его в качестве препарата для предотвращения уродств небезопасно, поскольку токсические и терапевтические дозы этого элемента весьма близки, в силу чего весьма вероятны токсические проявления действия селена от передозировки этого соединения.

Как известно, значительные успехи в снижении частоты врожденных уродств ЦНС были достигнуты при использовании комплекса витаминов в первый триместр беременности. Эффективность в этом случае достигается за счет снятия авитаминозов, являющихся фактором риска при развитии нервной системы. Очевидно, что утверждение о том, что соответствующий комплекс витаминов должен стать обыденным профилактическим средством при беременности, особенно на ранних стадиях, не вызывает возражений. Впрочем, как и профилактика любой иной алиментарной недостаточности.

Однако, как показывают экспериментальные и эпидемиологические данные, адекватная диета, являясь одним из факторов повышения неспецифической резистентности организма, все же не предотвращает эмбриогенез от патогенного действия значительного числа химических соединений с широки спектром повреждающего действия: алкилирующих соединений, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, соединений, индуцирующих перекисное окисление липидов и т.п. Одним из таких соединений, приводящим к развитию характерного синдрома уродств, получившего название "алкогольный синдром плода", является алкоголь (этиловый спирт). Этиловый спирт в организме метаболизирует до токсических (ацетальдегид, супероксидные радикалы и т.п.) и фармакологически активных (-карболины, тетрагидроизохинолины и др.) соединений, каждое из которых обладает существенной тератогенной активностью, вызывая не только морфологические уродства, но и глубокие поражения высшей нервной деятельности, вплоть до дебильности. Поэтому снижение тератогенного потенциала этилового спирта, являясь социально значимой задачей, одновременно важно и с общебиологических позиций как поиск фармакологических средств, предотвращающих тератогенное действие различных ксенобиотиков (неприродных синтетических средств), в том числе производственных вредностей и лекарств. При этом, использование химиотерапевтических средств для снижения токсического действия алкоголя во время беременности исключено, так как синтетические средства могут только усилить тератогенный потенциал этилового спирта. Примером этого является использование дисульфирама у страдающих алкоголизмом беременных женщин, приводящее к повышению тератогенного риска.

Известны также природные средства, снижающие токсическое действие этилового спирта за счет присущих им антиоксидантных свойств: препараты женьшеня (Panax ginseng), аралии и элеутерококка (Eleuterococcus).

Последний представитель аралиевых в эксперименте существенно снижал тератогенный потенциал этилового спирта, и поэтому рассматривается как ближайший аналог, решающий такую же задачу, что и новый применяемый объект.

Однако сырьевая база для получения препарата из корней элеутерококка весьма ограничена как вследствие ограниченного ареала распространения, так и вследствие истощения его природных ресурсов. Вышеназванные принципиальные ограничения использования аралиевых в качестве средств, снижающих алкогольную интоксикацию (а возможно и в качестве антитератогенных средств широкого спектра действия из-за присущих этим растениям адаптационных свойств) можно преодолеть за счет получения растительного материала индустриальным способом путем выращивания методом культур тканей, а также нахождением других представителей аралиевых с аналогичными свойствами, но более широки ареалом распространения.

Известно использование биомассы женьшеня, полученной путем выращивания его в культуре тканей, для мобилизации защитных сил организма.

Целью изобретения является обеспечение требуемого уровня противоэмбриотоксического эффекта антитератогенного средства на основе природных соединений по отношению к тератогенным воздействиям при расширении его сырьевой базы для получения антитератогена.

Это достигается применением биопрепарата (известной) культуры тканей растения Poliscias filicifolia (растительного адаптогена семейства аралиевых) в качестве антитератогенного средства.

Растительный адаптоген семейства аралиевых Poliscias filicifolia (полисциас папоротниколистный) является тропическим полукустарником, произрастающим на юге Вьетнама, в Таиланде, на Филиппинах, в Новой Зеландии. Несмотря на то, что ареалом произрастания рода Poliscias являются тропики и субтропики, биомасса Рoliscias filicifolia, может быть получена в значительном количестве методами культуры тканей растений (подобно биомассе женьшеня).

Во вьетнамской фармакопее и народной медицине Востока описано использование листьев и корней Poliscias filicifolia в качестве умеренного кардиотропного и психостимулирующего средства, а также средства нормализующего повышенное и пониженное давление.

Биопрепарат культуры ткани растений Poliscias filicifolia (полисциас) получают в настоящее время на Заводе биопрепаратов в г. Кириши и в СП "Пренатальная безопасность" в г.Санкт-Петербурге, а также на Экспериментально-производственном заводе "Санитас" в Литве. Паспорт одного из штаммов полисциас, полученный в Химико-фармацевтическом институте г.Санкт-Петербурга, был передан во Всесоюзную коллекцию культивирования клеток высших растений и утвержден Всесоюзной комиссией по клеточным культурам АН СССР.

Применение биопрепарата культуры тканей растений полисциас в качестве антитератогенного средства стало возможным благодаря впервые обнаруженным у этого препарата противоэмбриотоксических, антиоксидантных свойств, нормализующих нарушения активности ферментов антиоксидантной защиты: церулоплазмина, супероксиддисмутазы и уровня ПОЛ (перикисного окисления липидов), а также ферментов энергетического обмена: изоформ енолазы эмбриона при развитии алкогольного синдрома плода (АСП). Это позволяет получить отечественный антитератогенный препарат с обеспечением необходимого противоэмбриотоксического уровня на основе растительного сырья при полном отсутствии в России ареала выращивания природного растения.

Сопоставление признаков, характеризующих биопрепарат известной культуры тканей растений полисциас в его новом и известном применении показывает, что предлагаемый препарат не является простым дериватом листьев или корней интактного растения, используемых в народной медицине по известному назначению, и поэтому новое назначение биопрепарата не является прямым следствием известных свойств этого растения или других представителей семейства аралиевых.

Как следует из вышеизложенного, предлагаемый объект изобретения по сравнению с ближайшим аналогом того же применения элеутерококком (а именно: биомасса культуры ткани полисциас и экстракт из корней растения элеутерококка) имеют различающуюся совокупность существенных признаков. Применение биопрепарата полисциас с антитератогенными свойствами в общедоступной патентной и научно-технической литературе не описано, и, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "новизна".

Исходя из известного применения корней и листьев растения полисциас можно установить, что обеспечение противоэмбриотоксической и антиоксидантной защиты плода во время беременности является действительно новым назначением экстрактов тканей этого растения наряду с их применением для стимуляции центральной нервной и сердечно-сосудистой систем и, следовательно, известные свойства тканей растения не обуславливают со всей очевидностью возможности применения биомассы полисциас, получаемой в культуре тканей, как антитератогенного средства для защиты плода человека от токсического действия алкоголя и других токсических веществ. Таким образом, новое назначение заявляемого объекта не обусловлено известными свойствами тканей интактного растения, и, следовательно, данное изобретение не вытекает явным образом из известного уровня техники и соответствует критерию "изобретательский уровень".

Применение данного изобретения в акушерской практике для пренатальной защиты плода человека, а также более широкое его применение как средства предотвращения алкогольной интоксикации позволяет сделать вывод о соответствии данного изобретения критерию "промышленная применимость".

Предлагаемое изобретение проверено в лабораторных условиях Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН и СП "Пренатальная безопасность".

Стандартный способ приготовления биопрепарата полисциас заключается в трехкратной экстракции высушенной биомассы 40%-ным раствором этанола. Сырая биомасса на 90% состоит из паренхимных клеток размером от 30 до 90 мкм. После высушивания при 60^оС она представляет собой светло-желтую массу клеток с приятным специфическим запахом и вкусом. В биомассе выявлены следующие биологически активные вещества: 3-5% тритерпеновых гликозидов, 1% -ситостерина, 2% фруктозы, свободные аминокислоты, лизоглицерины и жирные кислоты. Ни одно из этих соединений прямо не указывает на возможность использования полисциас в качестве антиалкогольного или антитератогенного препарата, которое было обнаружено экспериментально.

В табл.1 приводятся экспериментальные данные, свидетельствующие о более эффективном предотвращении острой алкогольной интоксикации по сравнению с препаратами элеутерококка и биоженьшеня.

В этой серии экспериментов из биопрепаратов полисциас, приготовленных стандартным образом, выпаривали этанол, остаток лиофилизировали и растворяли в воде. Водный раствор полисциас вводили мышам в дозе 100 мг/кг одновременно с этанолом в дозе 8,8 г/кг массы (в предварительных экспериментах установленная как LD₅₀ летальная доза этанола, вызывающая 50% смертность мышей при однократном (остром) введении) внутрибрюшинно. Гибель животных регистрировали в течение суток после введения препаратов. В этих экспериментах полисциас в 100% случаев предотвращал гибель животных. В то же время препараты элеутерококка (использовали лиофилизированные аптечные препараты элеутерококка) и биоженьшеня, приготовленного тем же способом, что и препараты биополисциас, в той же дозе и при том же способе введения обладали существенно менее выраженным защитным эффектом. При этом наименьшее защитное действие оказывал препарат элеутеррококка. В этой связи в дальнейших сравнительных экспериментах в качестве эталонного аралиевого препарата использовали не известный аналог полисциаса по антитератогенному действию препарат элеутерококка, а еще более близкие как по способу получения, так и по антиалкогольной активности при острой алкогольной интоксикации, но менее известные из литературы препараты биоженьшеня.

Была также проведена серия экспериментов по предотвращению нарушений энергетического обмена при острой алкогольной интоксикации. При этом исследовали активность одного из важнейших ферментов энергетического обмена креатинкиназы. Креатинкиназа катализирует взаимопревращение креатина и фосфокреатина в реакции с участием АТР и АДР. В мозговой ткани креатинкиназа поддерживает стабильный уровень универсального макроэнергетического соединения АТР, необходимого, в частности, для синтеза нейромедиаторов и биоэлектрической активности мозга.

Этанол в виде 25%-ного раствора вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 3 г/кг за 3 ч до забоя животных. Фитопрепарат вводили аналогично в дозе 20 мг/кг за 1 ч непосредственно перед забоем. Активность креатинкиназы определяли непосредственно после забоя животных и выражали в МЕ (международных единицах) в расчете либо на 1 мг суммарного растворимого белка мозговой ткани, либо на 1 л сыворотки крови. Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Из табл.2 следует, что экстракт полисциаса полностью нормализовал вызванные этанолом подавление активности креатинкиназы в мозге и ее повышение в сыворотке крови. И в этом отношении полисциас был более эффективен, чем экстракт женьшеня при той же дозе.

В табл. 3 представлены также результаты опытов по предотвращению гибели плодов крыс при хроническом потреблении самками алкоголя в период беременности и лактации.

Добавление в питьевой раствор самок крыс (единственный источник питья 20% -ный раствор этанола) с первого дня беременности и до окончания лактации этанольного экстракта полисциас до конечной концентрации 0,8 (в расчете объем экстракта на объем раствора) приводило к тому, что доля погибших новорожденных в первые 2 недели жизни уменьшилась с 25% до 3%

Доля погибших в случае аналогичного использовали экстракта женьшеня в тех же дозировках составила 14%

Таким образом, экстракт полисциас оказался значительно более эффективным средством, чем экстракт женьшеня при предотвращении гибели плодов.

Был проведен также опытный анализ задержки развития плодов вызванной хроническим воздействием на самок алкоголя в период беременности и лактации. Результаты этого анализа приведены в табл.4.

Интоксикация алкоголем крыс приводила к уменьшению среднего числа новорожденных в помете на 25% и массы тела новорожденных в момент рождения на 16% а также к снижению скорости прироста массы тела в ходе постнатального развития на 26% (на протяжении первых 15 дней жизни) и к увеличению постнатальной гибели животных на 25%

Одновременно наблюдалась задержка формирования двигательных навыков по данным тестирования 16-дневных крысят по общепринятой методике открытого поля. Эта задержка выражается, во-первых, в уменьшении на 42% числа посещаемых квадратов поля и в сохранении маятникового рефлекса, который к этому сроку у контрольных животных уже практически исчезает (норма 1,7; алкоголизация самок 6,2).

Добавление экстракта полисциас в питьевой раствор этанола приводило к нормализации вызванной алкоголизацией самок задержке развития плодов по всем вышеуказанным параметрам.

Аналогичным действием, как следует из табл.4, обладает экстракт женьшеня. Однако его действие менее эффективно, так как он совершенно не обеспечивает увеличение количества новорожденных в расчете на 1 помет по сравнению с группой самок, получавших только раствор этанола и менее эффективно, чем полисциас, предотвращает постнатальную гибель (табл.3).

Далее была проведена серия опытов по доказательству у препаратов полисциас высокой антиоксидантной активности. Опыты, результаты которых представлены в табл.5, проводились на 14-дневных зародышах и новорожденных крысятах в возрасте 21 дня, а также через 1 мес после отмены алкоголя.

Уровень перекисного окисления липидов определяли методом измерения продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (2 ТБК) Для определения активности супероксиддисмутазы использовали модифицированный метод, основанный на ингибировании образцом, содержащим СОД (экстракт ткани, сыворотка крови) окисления НАДН, опосредованного супероксидными радикалами. Для определения активности церулоплазмина в экспериментах использовали метод Рейвина.

Добавление экстракта полисциас в питьевой раствор этанола приводило к снижению уровня перикисного окисления липидов до диапазона нормальных значений и к аналогичному изменению активности ферментов антиоксидантной защиты организма супероксиддисмутазы и церулоплазмина как в пре- так и в постнатальный период воздействия алкоголя (14-дневные зародыши и новорожденные крысята в возрасте 21 дня), так и для животных через 1 мес после отмены алкоголя. Таким образом, впервые доказано наличие у препаратов полисциас высокой антиоксидантной активности.

Сравнительное изучение нормализации вышеуказанных биохимических изменений с помощью экстрактов полисциас и женьшеня показывает, что по этому показателю препараты полисциас не уступают препаратам биоженьшеня и превосходят последний по ряду других тестов.

Помимо исследования антиоксидантных свойств полисциас и женьшеня был проведен анализ влияния этих препаратов на изоферментный спектр енолазы мозговой ткани. Енолаза является ферментом гликолитического пути, по которому в метаболизм тканей ЦНС поступает главный энергетический субстрат мозга глюкоза. В тканях животных енолаза представлена 3 димерными изоферментами: 13 --, -, -, причем -изоформа является нейроспецифической.

Результаты опытов этой серии экспериментов приведены в табл.6. Видно, что хроническая алкоголизация приводит к уменьшению доли активности -изофермента, причем это снижение сохраняется спустя значительное время после отмены этанола до 5 мес. Можно считать, что алкоголь вызывает необратимые изменения изоферментного спектра енолазы.

Добавление экстракта полисциас в питьевой раствор этанола приводило к полному восстановлению как удельной активности енолазы, так и динамики нарастания -изофермента в онтогенезе. В то же время применение экстракта женьшеня не вызывало подобных эффектов, и соотношение активностей изоферментов енолазы практически совпадало со спектром енолазы алкоголизированных животных.

На основании приведенных результатов экспериментов можно сделать выводы о том, что предлагаемое антитератогенное средство имеет ряд преимуществ по сравнению с выбранными аналогами, а именно:

препарат полисциас в значительно большей степени, чем препарат женьшеня уменьшает долю погибших плодов при хроническом отравлении алкоголем беременных и лактирующих самок;

препарат полисциас нормализует вызванную алкоголизацией беременных и лактирующих самок задержку развития плодов как по ростовым, так и по поведенческим показателям. Препарат женьшеня менее эффективен в этом отношении;

препарат полисциас эффективен в предотвращении гибели животных от острой алкогольной интоксикации, причем его действие выражено значительно более сильно, чем действие препаратов элеутерококка и биоженьшеня при сходных условиях опытов. Помимо этого, препарат полисциас нормализует активность креатинкиназы в мозговой ткани и сыворотки крови, превосходя по этой способности препараты биоженьшеня;

препарат полисциас обладает высокой антиоксидантной активностью, сравнимой с активностью такого мощного антиоксиданта, как женьшень.

Однако действие препарата полисциас при предотвращении биохимических изменений в тканях плода, вызванных хроническим отравлением алкоголем беременных и лактирующих самок не ограничивается лишь его антиоксидантными эффектами. Только полисциас обнаруживает способность к полной нормализации такого важного биохимического показателя энергетического метаболизма мозга, как изоферментный спектр енолазы.

В приведенном ниже примере показано, что препараты полисциас эффективны не только в предотвращении тератогенного действия алкоголя, но и защищают плод от воздействия тератогенов с иным спектром метаболической активности.

Для доказательства этого положения был использован наиболее изученный тератоген млекопитающих: антималярийный препарат хлоридин (2,4-диамино-5-парахлорфенил-6-этилпиримидин), тормозящий синтез ДНК и вызывающий у плодов крыс характерный комплекс уродств хлоридиновый синдром уродств.

По данным И. М.Акимовой максимальный эмбриотоксический эффект хлоридин оказывает на 1-е и 13-е сутки эмбриогенеза крыс. При внутрижелудочном введении хлоридина в дозе 1 мг/кг на ранних стадиях эмбриогенеза крыс (1, 2, 3 день беременности) доимплантационная гибель составила 67,1% а постимплантационная 54, 8% Комплексное введение полисциаса (1 мг/кг) и хлоридина (1 мг/кг) на 1, 2, 3 день беременности привел к снижению доимплантационной гибели почти вдвое 39,5% (р<0,05). Однако при этом способе введения постимплантационная гибель зародышей оставалась высокой (63,8%), по-видимому за счет имплантации нежизнеспособных зародышей.

При внутрижелудочном введении хлоридина в дозе 15 мг/кг на 13 день беременности (1 группа) постимплантационная гибель зародышей составила 7,5% аномальных зародышей 88,5% Все аномальные зародыши имели ярко выраженные характерные для хлоридина отечность, микроцефалию, гипогнатию, микромелию, укорочение хвоста, аномалии конечностей, включая брахидактилию, гемиомелию, гематомы на местах отсутствующих пальцев.

Средняя масса тела плода после воздействия хлоридином на 13 день беременности составила 1,540,21 г.

Напротив, при профилактическом введении препарата полисциас его антитератогенные свойства проявлялись вполне отчетливо. Так, при профилактическом введении препарата внутрижелудочно с 1 по 11 день беременности (в дозе 1 мг/кг) с последующим введением хлоридина на 13 день беременности (15 мг/кг) (II группа) и при предварительном введении полисциаса на 11, 12 и 13 день беременности (1 мг/кг) с совмещенным введением хлоридина на 13 день беременности в дозе 15 мг/кг (III группа) были получены следующие результаты.

Количество аномальных зародышей в I группе составило 88,5% во II группе 57,4% Таким образом, наиболее эффективное антитератогенное действие полисциас оказывает при длительном профилактическом введении.

Эмбриотоксическое действие хлоридина при одном и том же способе введения на 13 день беременности также достоверно зависело от введения полисциас и составляло 96,5% 68% и 58,8% в I, II и III группах соответственно.

Следует отметить, что спектр и тяжесть уродств изменяется при введении хлоридина на фоне препарата. Так, спектр аномалий в группе с предварительным введением полисциас с 1 по 11 день беременности (II группа) не отличается от комплекса аномалий в группе крыс, которым вводили только хлоридин (I группа). Напротив, после введения препарата непосредственно на фоне тератогена были отмечены только изолированные аномалии нижних конечностей (адактилия и брахидактилия) при отсутствии характерного хлоридинового синдрома уродств. Снижение эмбриотоксического эффекта в данной экспериментальной группе выражалось не только в снижении частоты появления аномальных зародышей и сужении спектра аномалий, но и в достоверном повышении средней массы плода практически до уровня контрольного значения 2,200,23 г по сравнению 1,550,25 г, когда хлоридин вводили изолированно.

Таким образом, исследование биопрепарата известной культуры тканей растительного адаптогена семейства аралиевых Poliscias filicifolia в качестве антитератогенного средства с широким спектром действия позволяет наряду с высокой антиоксидантной активностью повысить эффективность нормализации активности ферментов энергетического обмена по сравнению с известными антитератогенными средствами. Это, в свою очередь, позволяет повысить уровень противоэмбриотоксического эффекта антитератогенного средства на основе растительного сырья к тератогенным воздействиям при расширении его сырьевой базы для получения препарата.