способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПРЕССОРНОГО ЗВЕНА ИММУННОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА, включающий сбор периферической крови, получение суспензии мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования, блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культурах, отличающийся тем, что в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета-1-гликопротеин в дозе 3-120 мкг/мл суспензии МНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что суспензию МНК готовят из клеток, полученных в результате разделения в одноступенчатом градиенте фикол-уротраст.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование МНК осуществляют 48 ч.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что блокировку пролиферации осуществляют митомицином С.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование каждой тест-культуры проводят в течение 72 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к методам оценки активности Т-супрессоров.

Известен способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение суспензии чистых лимфоцитов для культивирования тест-культур с активатором супрессии и без него и дальнейшую оценку уровней их пролиферации (см. Dutton RW Inhibitory and stimulatory effects of Concanavalin A on the response of mouse splecn cells suspensions to antigen. I. Exp, Med. v. 138, p. 1496-1505, 1973. Journal of Experimental Medicine).

Однако известный способ требует использования в качестве активатора супрессии дефицитного и дорогостоящего импортного препарата конканавалина А.

По технической сущности наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение чистых лимфоцитов мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой части без активатора супрессоров, а второй с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования и блокировку пролиферации, добавление в каждую часть МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культурах (см. Shou L. cf al. Suppressor cels activity after conconavalin A treatment of lymphocytes from normal donors. F. Exp. Medicina, 1976, v.143 N 5, p.1100-1110).

Однако и этот способ требует использования дефицитного дорогостоящего импортного продукта конканавалина А.

Цель изобретения удешевление процесса определения за счет использования общедоступного и недорогостоящего активатора супрессоров и оценка возможности его применения в качестве лечебного средства.

Достигается это тем, что при способе определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающем сбор периферической крови, получение суспензии МНК, делении их на две равные части, культивирование МНК первой части без активатора супрессоров, а второго с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования и блокировку пролиферации, добавление в каждую часть МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культурах, в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета 1 гликопротеин (ТБГ), который используют в дозах от 3 до 120 мкГ, кроме того, получение суспензии МНК осуществляют методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-уротраст, при этом культивирование МНК осуществляют 48 ч, блокировку пролиферации осуществляют путем обработки МНК митомицином С, а культивирование каждой из тест-культур проводят в течение 72 ч.

Сущность изобретения заключается в том, что за счет использования ТБГ значительно удешевляется процесс определения, не требующий дефицитного препарата, а на основании полученных данных становится ясным возможность применения ТБГ в качестве лечебного средства в каждом конкретном случае. Ранее ТБГ применяли для определения срока беременности.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе получают суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте финолл-уротрасте (метод Boyum).

Периферическую кровь берут у диагностируемого больного путем венопункции в одно и то же время и помещают в пробирки с раствором гепарина из расчета 1 мл крови 20-30 ед. гепарина. Далее кровь разводят раствором Хенкса в соотношении 1:2 без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ и наслаивают на градиент фиколл-уротраст (плотность 1,078).

Затем производят центрифугирование в режиме 400 g в течение 30 мин. Взвесь МНК из интерфазы переносят в центрифужную пробирку, добавляют раствор Хенкса без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ и производят 3 последовательных центрифугирования по 10 мин для отмывания клеток от раствора фиколл-уротраст. После 3-го центрифугирования осадок МНК ресуспензируют в 1 мл среды 199 и подсчитывают количество мононуклеарных клеток с помощью камеры Горяева.

На втором этапе МНК делят на две равные части, первую из котоpых культивируют без активатора супрессоров, вторую с активатором супрессоров, в качестве которого используют трофобластический бета-1 гликопротеин (ТБГО).

МНК культивируют в пеницилиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками N 14,5 при температуре 37^оС. Среда культивирования РРМ1-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы и глютамина 300 мг.

В каждом флаконе культивируют 5х10⁶ клеток в 2,0 мл полной среды. В культуре для индукции супрессоров добавляют ТБГ в дозах 3-120 мкг/мл.

Культивирование клеток осуществляют 48 ч. После этого МНК отмывают от среды культивирования и осуществляют блокировку пролиферации путем обработки митомицином С 40 мкг/мл в течение 30 мин при 37^оС. Затем отмывают средой 199 с 5% сыворотки IV АВ (охлажденной) трижды. Осадок клеток ресуспензируют, подсчитывают количество ядросодержащих клеток, определяют процент жизнеспособности клеток с помощью 0,1%-ного трипанового синего раствора и разводят до необходимой концентрации. При этом все операции делают раздельно с контрольными клетками и со стимулированными ТБГ, а для отмывания клеток используют силиконированную посуду.

На следующем этапе в каждую часть контрольных и стимулированных ТБГ лимфоцитов добавляют свежевыделенные лимфоциты здорового донора, стимулированых фитогемагглютинином (ФГА), которые служат отвечающими тест-клетками в равных соотношениях (0,5х10⁶ 0,5х10⁶ клеток/мл) для получения тест-культур. Культивирование их проводят в течение 72 ч. После этого с помощью Н³ тимицина оценивают пролиферацию тест-культур и о величине супрессии судят по степени снижения пролиферации в них. Индекс супрессии (ИС) определяют по формуле:

ИС 1 100%

Для оценки супрессорного звена здорового человека были проведены диагностические исследования по ранее известной методике (прототип) и предлагаемому способу на группе здоровых лиц 100 человек. На основании полученных результатов норма активности Т-супрессоров при индукции конканавалином А составляет 56,8% 4% а по предлагаемому способу 63,44,7%

П р и м е р 1. Больной В. 30 лет, поступил в клинику с диагнозом рассеянный склероз цереброспинальная форма, находясь в стадии обострения процесса. Активность Т-супрессоров периферической крови при индукции конканавалином А 15% определенная по ранее известной методике определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Одновременно по предлагаемой методике определяли активность Т-супрессоров периферической крови этого же больного при индукции ТБГ, которая составила 17%

П р и м е р 2. Больная С. 40 лет, поступила в клинику диагнозом рассеянный склероз цереброспинальная форма, находясь в стадии обострения. Активность Т-супрессоров периферической крови при индукции конканавалином А 16% при известном способе диагностики. Одновременно по предлагаемой методике определяли активность Т-супрессоров этой же больной при индукции ТБГ, которая составила 190.

Проведена диагностика 150 больных с рассеянным склерозом и ревматоидным артритом. Отмечено, что активность Т-супрессоров при определении предлагаемым способом соответствует известному способу определения.

Причем следует указать, что использование конканавалина А для лечения указанных заболеваний противопоказано из-за его токсичности, в то время как ТБГ, вырабатываемый трофобластом человека, не обладает токсичностью и не вызывает аллергической реакции. Это дает возможным его использование в качестве лечебного препарата.