способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговицы

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ РОГОВИЦЫ, включающий гидролиз ткани активированным папаином при pH 6,0 - 6,5 и 60 - 65^oС с последующим диализом, отличающийся тем, что гидролиз роговицы проводят в течение 4 ч после добавления 50 - 55 мл 2,5%-ного раствора папаина к 1 кг сырой ткани, гидролизат кипятят 10 - 15 мин, добавляют трихлоруксусную кислоту до 5%-ной концентрации и диализуют после отделения осадка против смеси 1 н. раствора хлорида натрия и этанола в соотношении 7 : 3, насыщенного раствора хлорида натрия и дистиллированной воды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии в той ее части, которая занимается изучением компонентов соединительной ткани, а именно к способам выделения из тканей животных сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ). К сГАГ относятся связанные с белками кислые мукополисахариды хондроитинсульфаты, дерматансульфаты и кератансульфаты, а также гепарин и его производные, играющие важную роль в построении и обмене всех видов соединительной ткани, т.е. костей, хрящей, кожи, роговицы, склеры и т.д. Роговица, являющаяся сырьем в предлагаемом способе, содержит главным образом кератин-сульфат и хондроитин-4-сульфат.

Известен способ получения сГАГ из трахей крупного рогатого скота и плавников акул, включающий гидролиз суспензии ацетонового порошка из тканей 1% -ным раствором папаина в течение 1 сут при 62^оС, последующее осаждение гидролизата ацетоном, растворение осадка в физиологическом растворе, обесцвечивание с помощью KMnO₄ и осаждения ацетоном.

Однако этот достаточно простой и удобный способ не дает возможности получить высокочистый препарат сГАГ.

Наиболее близок к предлагаемому способу получения сГАГ из роговицы. Этот способ, выбранный прототипом, заключается в переваривании 600 г ткани в 1 л 0,1% -ного раствора активированного папаина в течение 1 сут при рН 6,2 и 60-65^оС с последующим фильтрованием, концентрированием гидролизата в 3 раза и осаждением сГАГ этанолом. Последующая очистка сГАГ и даже разделение их на хондроитин и кератан-сульфат достигается с помощью хроматографии препарата на смоле Дауэкс 1 х 2, после чего фракции, содержащие сГАГ, вновь осаждают этанолом, отмывают спиртом и эфиром и высушивают.

Способ-прототип позволяет получать высокоочищенные препараты сГАГ, однако выход конечных продуктов существенно снижен за счет потерь в процессе выделения. Кроме того, этот способ требует значительных затрат времени и реактивов.

Целью изобретения является увеличение выхода конечного продукта и уменьшение времени, необходимого для его получения.

Выход конечного продукта составляет 95,4% (по сравнению с 65-70% в прототипе), а время, необходимое для его получения сокращается с 8-10 дней в прототипе до 3-4 дней по предлагаемому способу.

Это достигается тем, что гидролиз роговиц активированным папаином при рН 6,0-6,5 и 60-65^оС проводят после добавления 50-55 мл 2,5%-ного раствора папаина на 1 кг сырой ткани в течение 4 ч, гидролизат кипятят 10-15 мин, добавляют к нему трихлоруксусную кислоту до 5%-ной концентрации, отделяют осадок, а раствор диализуют последовательно против смеси 1 н NaCl и этанола в соотношении 7:3, насыщенного раствора NaCl и дистиллированной воды.

Существенным признаком изобретения является то, что гидролиз роговицы папаином в известных условиях (при рН 6,0-6,5 и 60-65^оС) проводят, добавляя 2,5% -ный раствор фермента непосредственно к сырой ткани из расчета 50-55 мл фермента на 1 кг роговиц. Обычно для полноты прохождения реакции ткань предварительно суспендируют в большом объеме жидкости, добавляя для гидролиза низкие концентрации папаина. Полный гидролиз ткани не завершается раньше, чем через 1 сут, а большие объемы получаемого гидролизата приходится концентрировать для дальнейшей процедуры выделения и очистки сГАГ. В предлагаемом варианте гидролиз сырой ткани концентрированным раствором фермента позволяет за 2 ч получить в образующемся при растворении роговицы небольшом объеме гидролизата 45-60% исходного содержания сГАГ в ткани, а через 4 ч из 1 кг роговицы образуется порядка 1 л раствора, содержащего практически все с ГАГ исходного материала (табл.1). Таким образом, предлагаемый вариант гидролиза позволяет уменьшить общий объем гидролизата, исключить этап его концентрирования и в 5-6 раз сократить время полного гидролиза ткани.

Последующее кипячение раствора в течение 10-15 мин и добавление трихлоруксусной кислоты до 5%-ной концентрации обеспечивает не только полную денатурацию оставшихся белков, но и инактивацию протеолитической активности ферментов в растворе.

К существенным признакам изобретения относится также диализ полученного раствора: сначала против смеси 1 н NaCl и этанола в соотношении 7:3, а затем против насыщенного раствора NaCl. Диализ против смеси хлорида натрия и этанола позволяет эффективно очистить раствор сГАГ от низкомолекулярных соединений и липидов, исключить этап осаждения сГАГ в этаноле и существенно снизить потери сГАГ за счет устранения этапов растворения осадков и их переносов. Последующий диализ против насыщенного раствора хлорида натрия позволяет удалить из препарата низкомолекулярные соединения, связанные с сГАГ электростатическими связями. Окончательный интенсивный диализ против дистиллированной воды обеспечивает удаление хлорида натрия и полную очистку сГАГ.

Сопоставительный анализ предлагаемого способа с аналогами и прототипом позволяет заключить, что подобного способа выделения сГАГ из животных тканей не описано, что дает основание считать предлагаемый способ соответствующим критерию новизны.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. К 1 кг роговиц, предварительно отмытых 0,02 М фосфатным буфером рН 6,0-6,5 добавляют 50-55 мл раствора содержащего, г: папаин 1,25; азид натрия 0,2; цистеин хлорид 0,9; этилендиаминтетрауксусная кислота в 0,02 М фосфатном буфере рН 6,0-6,5 1,9.

Смесь инкубируют при 60-65^оС в течение 4 ч при постоянном перемешивании, в результате чего происходит практически полный гидролиз ткани. Гидролизат кипятят 10-15 мин, добавляют ТХУ до 5%-ной конечной концентрации, отделяют осадок центрифугированием, а прозрачный гидролизат диализуют сначала против смеси 1 н хлористого натрия и этанола в соотношении 7:3, затем против насыщенного раствора хлористого натрия и окончательно против дистиллированной воды.

Из 1 кг сырой ткани удается выделить 5,340,12 г сГАГ, что составляет 95,40,9% от содержания сГАГ в сырой ткани (табл.1). Общее содержание сГАГ определяют по окрашиванию с 1,9-диметиленовым синим.

Полученный препарат сГАГ в расчете на сухой вес содержит, гексозамин 29-37; гексуроновые кислоты 12-14; сульфат 18-21; белок 1-4.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что химический состав полученного препарата характерен для сГАГ, причем отчетливо заметно преобладание сГАГ с малым содержанием уроновых кислот. По-видимому, это отражает присутствие в препаратах большего количества кератан-сульфата, чем хондроитин-сульфатов, поскольку кератан-сульфат в отличие от хондроитин-сульфатов вместо уроновых кислот содержит гексозу, а именно галактозу.

Поэтому после предварительной обработки препарата -гиалуронидазой, которая гидролизует только хондроитин сульфат, в нем вновь было определено содержание сГАГ с помощью 1,9-диметиленового синего (табл.2). Таким образом, полученный с помощью предлагаемого способа препарат представляет собой смесь хондроитин-сульфатов и кератан-сульфата в соотношении 1:2.

Полученный с помощью предлагаемого способа препарат сГАГ оказался эффективным биологическим средством. Экспериментально установлено его положительное действие на активацию обмена соединительной ткани и на подавление процессов развития воспаления.

Эксперименты на культуре клеток роговицы. Монослойную культуру клеток роговицы человека получали из биоптатов роговицы, полученных из донорского банка МНТК МГ. В стерильных условиях роговицу резали на кусочки размером до 1 мм² и эксплантировали в пластиковые флаконы с площадью дна 25 см². Культуральная среда содержала 90% среды Игла и 10% инактированной сыворотки человека, а также антибиотики пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (60 мкг/мл). Смену культуральной среды проводили 2 раза в неделю и после формирования во флаконе клеточного монослоя, его обрабатывали 0,25% раствором трипсина для получения суспензии клеток.

Для изучения влияния препарата сГАГ клетки в количестве 2,0-5,0 х 10⁴ помещали в каждую лунку двадцатичетырехлуночной пластиковой платы и культивировали в среде с сывороткой в течение 2-3 дней. Затем проводили смену культуральной среды, в которую добавляли различную концентрацию препарата от 0,02 до 0,2 мг/мл и меченные предшественники. Культивирование продолжали в течение последующих 24-48 ч, клеточный монослой отмывали, гидролизовали в щелочи и величину радиоактивности просчитывали на сцинтилляционном счетчике. Размножение клеток определяли по величине включения ³Н-тимидина (0,5 мкКИ/мл), общего обмена по включение ¹⁴С-уридина, продукции коллагена по включению ¹⁴С-пролина (5 мкКИ/мл) в ¹⁴С-оксипролин и продукции протеогликанов по включению ³⁵SO₄ (5 мкКИ/мл).

Каждая экспериментальная точка была представлена не менее, чем 4-5 параллельными определениями.

Полученные результаты показали, что препарат сГАГ оказывает стимулирующее дозо-зависимое действие на пролиферацию и обмен клеток роговицы в культуре (табл.3).

Кроме этого, проводили непосредственный подсчет клеток в препаратах культур, после их фиксации и окраски на Морфометре "Оптон" (ФРГ). Было показано, что препарат сГАГ, в отличие от коммерческого хондроитин-сульфата типа А, достоверно стимулирует пролиферацию кератоцитов человека в культуре (контроль 163210, хондроитин-сульфат 1635 10 и сГАГ 2085 10 клеток на ячейку поля морфометра) при концентрации препарата 0,1 мг/мл.

Изучение влияния препарата сГАГ на органную культуру эксплантатов роговицы кролика также продемонстрировало стимулирующий эффект на пролиферацию кератоцитов.

В условиях ин витро препарат сГАГ в концентрации 0,1 мг/мл полностью подавлял активность 0,1%-ного раствора пепсина при инкубации фермента с субстратом "Азоколл". Полученный факт указывает на подавление препаратом сГАГ активности кислых протеиназ, что может иметь существенное значение в условиях развития воспаления, где активность данных ферментов резко увеличена.

Эксперименты на животных в условиях ин виво. Испытания были проведены на кроликах породы Шиншилла (40 животных 80 глаз). Экспериментальным животным под местной анестезией наносили радиальные надрезы роговицы на 2/3 ее толщины. Сразу после операции закапывали раствор препарата сГАГ в различных концентрациях (0,02; 0,05; 0,1 и 0,2 мг/мл) 6 раз в сутки по 0,1-0,2 мл в оперированный глаз. В контроле проводили аналогичное закапывание физиологического раствора. Биомикроскопические наблюдения проводили в динамике на 3, 7, 14 и 30 дни после операции. На эти сроки животных убивали воздушной эмболией, вырезали роговицы и готовили препараты для гистологических исследований на световом и электронно-микроскопическом уровнях. Было установлено:

1. Через 3 сут после инстилляции 0,02 мг/мл сГАГ выявлено снижение воспалительной реакции со стороны конъюнктивы (умеренная гиперемия), отсутствие слезотечения, снижение светобоязни. Гистоморфологический разрез узкий, выполнен эпителиальной пробкой, макрофагальная инфильтрация не изменена, по сравнению с контролем, количество активированных фибробластов под разрезами увеличено. При инстилляции 0,05 мг/мл отмечаются те же положительные явления, но при этом наблюдается снижение макрофагальной реакции. При концентрации препарата 0,1 и 0,2 мг/мл воспалительная реакция и инфильтрация макрофагами практически отсутствуют и отмечается резкое увеличение количества кератоцитов в зоне повреждения.

2. На 7-14 сут после операции при всех концентрациях препарата сГАГ наблюдалось выраженное противовоспалительное действие, сравнимое по эффективности с гормональными препаратами (дексаметазон в количестве 0,1 мл 1,5% р-ра), которые в части экспериментов были использованы в виде контроля.

3. Через 30 сут после операции в местах разрезов строма роговицы не имеет пустот и разрывов и в основном заполнена межуточным веществом. Базальная пластина полностью сформирована, под ней выявляется большое количество активированных фибробластов с хорошо развитым шероховатым ретикулумом, имеющим большое число полирибосом. Последнее прямо доказывает повышенный синтез белка этими клетками.

Следовательно, отмечается дозо-зависимое действие препарата сГАГ как противовоспалительного агента с наилучшим эффектом в дозе 0,1 мг/мл. Одновременно происходит активация стромальных элементов роговицы и ускоряются процессы регенерации ткани.

Приведенные данные о биологической активности полученных предлагаемым способом препаратов сГАГ свидетельствуют о том, что эти препараты могут быть использованы в широкой офтальмологической практике в качестве лекарственных средств при лечении кератинов и конъюнктивитов различной этиологии, помутнения роговицы (бельма, ожоги, эпителиально-эндотелиальная дистрофия), после кератотомии, кератопластики, кератомилеза, различных операциях с применением лазера потому, что препарат сГАГ оказывает выраженное стимулирующее действие на регенерацию роговицы и восстановление ее обменных характеристик.

Кроме того, предлагаемый способ по-лучения сГАГ достаточно технологичен и может быть легко воспроизведен в промышленных условиях и масштабах.