способ биологической оценки токсичности вносимых в почву веществ

Формула изобретения

СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ВНОСИМЫХ В ПОЧВУ ВЕЩЕСТВ, включающий культивирование тест-объекта в исследуемой и контрольной средах с последующим определением физиологических показателей, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют нематод p. Cephalobus, культивируют их в течение трех поколений, в первом поколении определяют прирост численности популяции нематод и токсичность оценивают по статистически достоверному уменьшению прироста численности по сравнению с контролем, дополнительно определяют численность живых и мертвых особей нематод в третьем поколении, кумулятивное действие токсичных веществ оценивают по выживаемости, при этом если выживаемость в опыте составляет 50% и менее, то вещество относят к токсичным с кумулятивным эффектом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к охране окружающей среды и токсикологии почв и может быть использовано для биологического контроля токсичности веществ, вносимых в почву, а также для определения оптимальных доз внесения удобрений и компостов, полученных с использованием отходов производств, позволяющих получить максимальную продуктивность растений при обеспечении экологического мониторинга используемых земель.

В настоящее время токсичности веществ в почве определяют химическими методами, которые позволяют определить абсолютное количество токсического вещества, но не дают возможности оценить пригодность таких почв для культивирования растений и обеспечения нормальной жизнедеятельности микро- и мезофауны почв, которые принимают активное участие в деструкции органических веществ в почве [1]

Известен способ определения фитотоксичности почвы, согласно которому, определяют всхожесть семян на почвенных пластинках, которые переувлажняют, а затем сверху наносят слой сухого стерильного песка и выдерживают в течение 20-30 ч. По разности всхожести семян в контроле и испытуемом образце судят о степени токсичности почвы [2]

Однако данный способ, не предполагает выращивания растений до получения урожая, а только позволяет определить взойдут семена или нет, и поэтому нельзя определить, как будет развиваться растение в течение всей вегетации, т. е. невозможно сделать вывод о пригодности почвы для культивирования растений. Способ также не позволяет судить о влиянии токсикантов на микро- и мезофауну почвы.

Известно также, что при исследовании токсичности жидких сред, в частности естественных и искусственных водоемов, используют водных беспозвоночных, например дафний, которые являются надежными тест-объектами в экспресс методах. При этом в качестве показателя физиологического состояния дафний регистрируют изменение частоты движений их эпиподитов, о токсичности воды судят по разности средних частот движений эпиподитов в опытной и контрольной группах, а оценку степени токсичности производят по величине промежутка времени, в течение которого достигается снижение средней частоты движений эпиподитов дафний в опытной группе на 50% по сравнению с частотой движения эпиподитов дафний в контрольной группе [3]

Данный способ является эффективным и обладает достаточной чувствительностью для определения токсичности веществ, растворенных в воде. Однако он не пригоден для оценки токсичности почв, поскольку микрофауна являясь обитателем парцеллярной (пленочной) воды, не переносит переувлажнение и затапливание. Поэтому нельзя однозначно экстраполировать результаты, полученные на водных организмах на почвенную микро- и мезофауну.

Кроме того, многие токсичные вещества и ионы металлов выступают как кумулятивные яды и их токсичность проявляется не сразу, а через несколько поколений. Использование экспресс-методов в таких случаях не позволяет определить кумулятивное действие токсических веществ.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и определение кумулятивного токсического действия вносимых в почву веществ.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу биологической оценки токсичности веществ, вносимых в почву путем культивирования тест-объекта в контрольной и исследуемой среде, в качестве тест-объекта используют нематод рода Серhalobus, культивируют их в течение трех поколений, определяют прирост численности популяции нематод в первом поколении в контроле и опыте, сравнивают полученные данные и оценивают токсичность вещества по изменению прироста численности популяции тест-организмов по сравнению с контролем, при этом испытываемую концентрацию вещества считают токсичной, если прирост численности популяции статистически достоверно меньше чем в контроле, а кумулятивное действие токсичных веществ оценивают в третьем поколении популяции, определяя численность живых и мертвых особей нематод в контроле и в исследуемой среде, сравнивают полученные показатели выживаемости тест-объектов, при этом, если выживаемость в опыте составляет 50% и менее от контрольной, то испытываемое вещество относят к токсичным с кумулятивным эффектом.

Сравнительный анализ признаков заявляемого и известного (прототипа) технических решений показал, что заявляемый способ отличается наличием нового тест-объекта, используемого для определения токсичности веществ, вносимых в почву и новыми критериями оценки токсичности веществ, а также веществ, обладающих токсическим кумулятивным эффектом, что позволяет сделать вывод о соответствии способа критерию "новизна".

Нематоды рода Серhalobus относятся к группе почвенных сапрофитов, принимают активное участие в деструкции органического вещества и осуществляют передачу потока энергии через экосистему от мезофауны к микрофауне, в том числе микроорганизмам, завершающим конечную трансформацию веществ в доступную для растений форму. Такая деятельность почвенных нематод, учитывая их высокую численность в минеральных и торфяных почвах (6 тыс. 30 млн/м²) свидетельствует о том, что они являются мощным фактором круговорота веществ и почвообразовательных процессов, обеспечивающим плодородие и экологическое благополучие почвы. Важной особенностью нематоды рода Серhalobus является высокая их плодовитость при коротком онтогенетическом цикле, что обусловило их использование в виде модельной лабораторной культуры при проведении экспериментальных исследований по биохимии и биоэнергетике почвенных нематод.

Заявителю не известно использование нематод рода Серhalobus в качестве тест-объекта при исследовании токсичности веществ, вносимых в почву.

Сопоставление заявляемого способа с другими техническими решениями в данной области не выявило решений, отличительные признаки которых проявляли бы аналогичные свойства. Таким образом, отличительные признаки заявляемого способа являются новыми существенными признаками, совокупность которых обеспечивает повышение чувствительности способа и возможность оценки кумулятивного эффекта токсических веществ, вносимых в почву. Поэтому можно сделать заключение, что предлагаемый способ соответствует также критериям "существенные отличия" и "положительный эффект". Испытание способа проводили на активном иле Кондопожского и Сегежского ЦБК, который используют для получения компостов и органо-минеральных удобрений. Активный ил продукт микробиологического синтеза, полученный при очистке сточных вод целлюлозно-бумажных производств. Химический состав активных илов подвержен значительным изменениям в зависимости от способов получения целлюлозы и режимов его обезвоживания и сушки. Исследуемые образцы содержали: Протеины 39,7-40,4 Жир до 5,2% Вит. В₁₂ 8,8 мкг/кг

Безазотистые экстрак- тивные вещеcтва (БЭВ) 35%

Минеральный состав следующий, к/кг аб. с.в-ва: Кремний 2,1-4,3 Титан 0,06-0,18 Алюминий 0,7-3,1 Железо 4,1-20,5 Марганец 0,7-0,8 Ртуть 0,006-0,01 мг/кг Хром 0,01-0,20 Ванадий 0,12-1,2 Медь 0,12-0,5 Стронций 0,37-5,3 Никель 0,06-0,59 Барий 0,25-3,2 Нитраты 555-2450 мг/кг

П р и м е р 1. Исследование токсичности двух партий активного ила Кондопожского ЦБК с помощью тест-объекта нематод рода Серhalobus (Серhalobus реrsegnis). Брали активный ил первой партии и развешивали в биологические пробирки по 10, 100 и 500 мг и добавляли по 10 мл 2% бактоагара "Дифко", автоклавировали при 0,5 атм. 20 мин, разливали в стерильные чашки Петри, подсаживали в каждую чашку по 2 самки (I-я серия опытов). Аналогично поступали с второй партией ила (II-я серия опытов). Контролем служил 2% бактоагар "Дифко" без добавки активного ила. Каждая серия имела 5 повторностей. Культивирование проводили в стерильных условиях при 18-20^оС в течение 12 дней до формирования I-го поколения популяции. Затем нематод вместе с питательной средой переносили в химические стаканы. Объем воды доводили до 100 мл и интенсивно перемешивали 10 мин. Численность устанавливали методом прямого счета в одной капле (0,03 мл) в трех повторностях с последующим пересчетом на весь объем жидкости. Результаты исследований обрабатывали статистически, определяя математическую ошибку и отклонения от среднего значения с помощью ПЭВМ. Параллельно проводили испытание активного ила на острую токсичность на двух группах мышей, которым внутрижелудочного (трехкратно) вводили активность ил, разведенный в твине. Разовая доза на мышь составляла 10000 мг/кг массы тела, что составляет 500 мг на мышь. Токсичность оценивали по гибели подопытных животных и визуальным патологоанатомическим изменениям внутренних органов погибших или декаптированных мышей. Результаты исследования приведены в табл.1.

Сравнение численности тест-объектов, полученной в I-м поколении популяции в I-й серии опытов при различных концентрациях активного ила с контролем, показывают, что исследуемые концентрации активного ила 10, 100 и 500 мг (которые при пересчете соответствуют внесению в почву количества активного ила в кг на 1 га: 10, 100, 500) дают статистически достоверно больший прирост численности тест-организмов в 2-4 раза, что свидетельствует о нетоксичности исследуемых доз I-й партии активного ила.

Сравнение прироста численности нематод, полученного в I-м поколении популяции во II-й серии опытов при различных концентрациях II-й партии активного ила с контролем показывает, что все исследуемые концентрации активного ила дают статистически достоверно меньший прирост численности тест-организмов в 3-8 раз, что позволяет сделать вывод о токсичности всех исследуемых доз II-й партии активного ила.

После завершения формирования I-го поколения популяции и подсчета в нем прироста численности нематод, брали по пять самок из всех пяти чашек серии, помещали в часовое стекло с дистиллированной водой на 15-20 мин, затем пересевали по две самки в каждую новую серию и таким образом было получено два поколения популяции II-е и III-е.

Исследование кумулятивного токсического воздействия проводили на третьем поколении популяции нематод, поскольку, как показали эксперименты, наиболее четкая корреляция между концентрацией токсических веществ, приростом численности и выживаемость нематод была получена в третьем поколении. Поэтому определяли прирост численности нематод в III-м поколении, а также численность живых и мертвых особей в двух сериях опытов и в контроле. Данные представлены в табл.2.

Затем сравнивали процент выживаемости нематод в популяциях III-го поколения в опыте и контроле. На основании сравнения можно сделать вывод, что в I серии опытов доза в 10 и 100 мг не обладает кумулятивным эффектом, так как выживаемость нематод составляет более 50% (98,3% и 83,5% соответственно), доза в 500 мг (что соответствует 500 кг/га) несмотря на то, что обеспечивает высокий прирост численности как в I-м, так и в III-м поколениях популяции, как показывает очень низкий показатель выживаемости 6,8% эта концентрация оказывает токсическое кумулятивное действие на нематод и приводит к их гибели.

Во второй серии опытов также проводили сравнение процента выживаемости нематод в III-м поколении популяции в исследуемых концентрациях активного ила с величиной этого показателя в контроле, на основании чего сделали заключение, что концентрация активного ила в 100 мг и 500 мг является токсичной с кумулятивным эффектом, о чем свидетельствует низкий процент выживаемости, соответственно 15,0% и 3,3%

Таким образом, проведенные исследования по предлагаемому способу позволяют сделать заключение, что активный ил I партии можно вносить в почву однократно в дозе до 500 кг/га, так как в дозе 500 кг/мг он проявляет кумулятивный эффект, а активный ил II-й партии во всех исследованных концентрациях от 10 до 500 кг/га является токсичным, и в дозе от 100 до 500 кг/га и более оказывает токсичный кумулятивный эффект.

Опыты на острую токсичность на мышах показали, что активный ил I партии нетоксичен, а II-я партия активного ила токсична, что подтверждает наши выводы, но в то же время заявляемый способ обладает большей чувствительностью, так как позволяет определить кумулятивное действие активного ила I партии в дозе 500 кг/га.

П р и м е р 2. Исследование токсичности активного ила Сегежского ЦБК с помощью тест-объекта нематод рода Серhalobus (Серhalobus реrsegnis). Ход определения токсичности тот же, что в примере 1. Результаты исследования приведены в табл.3.

Исследование прироста численности тест-организмов в I-м поколении популяции показало, что исследуемые концентрации активного ила Сегежского ЦБК (10, 100 и 500 мг) дают статиcтически достоверно больший прирост численности нематод на 9-140% что свидетельствует о нетоксичности исследуемых доз активного ила. Сравнение выживаемости тест-организма в III-м поколении популяции, полученное в опыте с контрольной средой, показало, что величина этого показателя близка к значению его в контроле и составляет более 50% (72,3-87,1% ). На основании этого можно сделать вывод о том, что исследуемые концентрации активного ила Сегежского ЦБК являются нетоксичными и не обладают кумулятивным действием.

В экспериментах на мышах были получены аналогичные результаты (выживаемость мышей составила 100%).

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью за счет возможности производить оценку токсичности веществ, вносимых в почву как в микро (10 кг/га), так и макродозах (500 и выше кг/га), а также определить кумулятивный токсический эффект, что позволяет судить о состоянии исследуемых почв с точки зрения обеспечения жизни микро- и мезо- фауны почв, что открывает возможность оценки и прогнозирование экологической ситуации.