способ получения гибридного белка 
1 -тимозин-фактор некроза опухолей-
| Классы МПК: | C12P21/00 Получение пептидов или протеинов C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона C07K7/00 Пептиды, содержащие от 5 до 20 аминокислот с полностью определенной последовательностью; их производные |
| Автор(ы): | Шмелев В.А., Носова Л.Ю., Бунина З.Ф., Новикова Н.И. |
| Патентообладатель(и): | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии |
| Приоритеты: |
подача заявки:
1992-07-29 публикация патента:
10.03.1996 |
Использование: биотехнология. Изобретение позволяет обеспечить стабильное наследование плазмиды в процессе культивирования, а также получать максимальный синтез гибридного белка путем культивирования штамма E. coli с плазмидой pThy - 230 в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка хроматографией на гибридных носителях (фенил-), анионообменниках (ДЕ-, ДЕАЕ-) и матрицах с иммобилизованным голубым красителем (Cibarcon Blue), причем культивирование проводят при температуре 30 - 34oС, а в надосадочную жидкость после лизиса клеток при pH 5,8 - 6,0 добавляют сухой сульфат аммоний до 28 - 30% насыщения, отделяют образовавшийся осадок, надосадочную жидкость наносят на гидрофобный носитель, уравновешенный буфером с сульфатом аммония до 33% насыщения при pH 5,8 - 6,0, носитель промывают буфером без сульфата аммония при pH 5,8 - 6,0 и элюируют гибридный белок этим же буфером, содержащим дополнительно 6 М мочевины, фракции с гибридным белком наносят на анионообменный носитель при pH 5,6 - 5,8 в буфере с 7 М мочевиной, элюцию ведут тем же буфером с добавлением до 150 мМ NaCl, фракции гибридным белком наносят на матрицу с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенную буфером с 7 М мочевиной при pH 5,5 - 5,8 и элюируют белок буфером при pH 7,8 в присутствии 7 М мочевины и 0,4 М NaCl, с последующим диализом против раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата, при pH 7,2 - 7,4.
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1- ТИМОЗИН-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ- , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> путем культивирования штамма Escherichia Coli SG20050, трансформированного плазмидой pThy230, кодирующей синтез гибридного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка, отличающийся тем, что культивирование проводят при 30 - 34oС, в надосадочную жидкость, полученную после лизиса клеток, при pH 5,8 - 6,0 добавляют сульфат аммония до 28 - 30% насыщения, отделяют образовавшийся осадок, а надосадочную жидкость наносят на гидрофобный сорбент, уравновешенный буфером с сульфатом аммония до 33% насыщения при pH 5,8 - 6,0, носитель промывают буфером без сульфата аммония при pH 5,8 - 6,0 и элюируют гибридный белок этим же буфером, содержащим 6 М мочевины, после чего фракции с гибридным белком при pH 5,6 - 5,8 в буфере с 7 М мочевиной наносят на анионообменник, элюцию ведут тем же буфером с добавлением NaCl до 150 мМ, полученные фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевиной при pH 5,5 - 5,8 и элюируют белок буфером при pH 7,8 в присутствии 7 М мочевины и 0,4 М NaCl с последующим диализом при pH 7,2 - 7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гибридного белка, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1 -тимозин-фактор некроза опухолей , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">. Известен способ получения гибридного белка , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -фактор некроза опухолей-тимозин-, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1 (ФНО-Т), кодируемый рекомбинантной плазмидной ДНК pThy314 [1] Указанная плазмида кодирует синтез также белков устойчивости к антибиотикам , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055068/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазу и хлорамфениколацетилтрансферазу. Гибридный белок ФНО-Т получают культивированием штамма E.coli SG20050 [2] с плазмидой pThy314. Штамм трансформируют плазмидой и высевают на чашку Петри с питательным агаром, содержащим ампициллин. Выросшие колонии используют для пересевов и последующего хранения (в том числе в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ Генетика) или для культивирования в питательном L-бульоне, сначала в пробирках или колбах, а затем в ферментере. Недостатком указанного способа является невысокий уровень синтеза гибридного белка из-за нестабильности штамма SG20050 с плазмидой pThy314 при хранении на плотных питательных средах. Способ очистки гибридного белка Т-ФНО неизвестен. Задачей изобретения является создание способа получения гибридного белка Т-ФНО, обеспечивающем стабильное наследование плазмиды в процессе культивирования и получение максимального синтеза гибридного белка. Указанная задача решается культивированием свежеполученных трансформантов штамма Е.coli SG20050 плазмидой pThy230 в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка хроматографией на гидрофобных носителях (фенил-), анионоообменниках (ДЕ-, ДЕАЕ-), матрицах с иммобилизованным голубым красителем (Cibacron Blue F3GA), причем культивирование проводят при температуре 30-34оС, а в надосадочную жидкость после лизиса клеток при рН 5,8-6,0 добавляют сухой сульфат аммония до 28-30% насыщения, отделяют образовавшийся осадок, надосадочную жидкость наносят на гидрофобный носитель, уравновешенный буфером с сульфатом аммония до 33% насыщения при рН 5,8-6,0, носитель промывают буфером без сульфата аммония при рН 5,8-6,0 и элюируют гибридный белок этим же буфером, содержащим дополнительно 6 М мочевины, фракции с гибридным белком наносят на анионообменный носитель при рН 5,6-5,8 в буфере с 7 М мочевиной, элюцию ведут тем же буфером с добавлением до 150 мМ NаCl, фракции с гибридным белком наносят на матрицу с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенную буфером с 7 М мочевиной при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером при рН 7,8 в присутствии 7 М мочевины и 0,4 М NaCl, с последующим диализом против раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата, при рН 7,2-7,4. Гибридный белок, полученный этим способом, имеет молекулярную массу 22, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055001/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1 кДа по подвижности в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН), чистоту более 95% по данным электрофореза ПААГ-ДСН и обладает цитотоксичностью, свойственной ФНО, для клеток фибросаркомы мыши линии L-929, 2х х107 ЕД/мг. При кислотном гидролизе белка в 80%-ной муравьиной кислоте при 37оС в течение 40-48 ч происходит его расщепление на два фрагмента: ФНО с молекулярной массой 17,5, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055001/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">0,5 кДа и тимозин , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1 с молекулярной массой 3,1, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055001/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">0,1 кДа. Гибридный белок Т-ФНО взаимодействует с антисыворотками против ФНО и тимозина , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055041/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">1 в иммуноферментном анализе. П р и м е р 1. Выращивают штамм E.coli SG20050 в 5 мл LB при 37оС в течение ночи. Разводят культуру свежим LB в 50-100 раз и растят на качалке при 37оС до оптической плотности при 590 нм равной 0,2-0,3. Если оптическая плотность более 0,3, культуру разводят свежим LB до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4о С 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl2, охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 мин на льду. Осаждают клетки 10 мин при 5000 об/мин, 4оС. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М СаСl2, охлажденного на льду. К компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки для трансформации до трех месяцев при -70оС. Переносят 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК pThy230. Инкубируют на льду 1 ч. Переносят пробирку на 42о С 5 мин. Переносят клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37оС L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37оС 1-1,5 ч. Заполняют ферментер вместимостью 10 л L-бульоном объемом 7 л с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Прогревают ферментер до необходимой температуры и вносят посевную дозу 100 мл L-бульоной культуры свежеполученных трансформантов. Культивируют при необходимой температуре, 250-300 об/мин с продувкой воздуха 0,5 л/мин на л бульона. При достижении стационарной фазы роста бульон сливают, берут пробу для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% ПААГ-ДСН. Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и используют для выделения гибридного белка. Экспериментально определено, что культивирование штамма SG20050 (pThy230) при 30-34оС приводит к образованию 100% гибридного белка в растворимой форме; при 37оС 90%П р и м е р 2. Использование консервированных клеток трансформированного штамма Е.coli для культивирования и получения гибридного белка. Трансформацию штамма Е.соli SG 20050 плазмидой и культивирование свежеполученных трансформантов проводят как в примере 1, за исключением: а) в экспоненциальной фазе роста штамма производят отбор культуры, добавляют стерильный глицерин до 40% и хранят клетки при минус 20-40оС в течение нескольких месяцев. Для последующих культивирований в 10 л ферментере используют в качестве посевного материала консервированные клетки трансформированного штамма. Клетки, выросшие до стационарной фазы роста, непригодны для последующих культивирований; б) для культивирования в большем объеме клетки в экспоненциальной фазе роста из 10 л ферментера используют как посевной материал для инокуляции в 100 или 250 л ферментер. П р и м е р 3. Выделение и очистка гибридного белка Т-ФНО. Клетки штамма SG20050 с плазмидой рThy230, выращенные при 30-34оС, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4оС в течение 10 мин. Бульон сливают, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl рН 7,5 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфтрида, из расчета на 1 г клеток 10 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например: замораживанием-оттаиванием, или импульсами ультразвука три раза по 40 сек, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру в French-прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4оС, 5000g. Надосадочную жидкость сливают, титруют уксусной кислотой до рН 5,8. Добавляют небольшими порциями сухой сульфат аммония до 28% насыщения. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре, центрифугируют 8000 g 10 мин. Супернатант сливают и наносят на колонку с фенил-сефарозой, уравновешенной 25 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,6 (на 30 мл носителя около 100 мл лизата). Промывают колону сразу после нанесения белка 25 мМ Nа-ацетатным буфером рН 5,8, а затем элюируют белок 7 М раствором мочевины в том же буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, наносят на колонку с носителем ДЕАЕ, уравновешенным 25 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной. Загрузка на 100 мл носителя около 100 мл белка. Промывают колонку 25 мМ Nа-ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной и 150 мМ NaCl. Фракции с гибридным белком наносят на колонку с голубой агарозой, уравновешенной 25 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной и 0,4 М NaCl. К образцу белка, фракции с ДЭАЭ, добавляют 1/100 объема 100 мМ ФМСФ и NaCl до 0,4 М. Наносят белок объемом до 200 мл на 30 мл носителя. Элюируют белок 50 мМ Na-фосфатным буфером рН 7,8 с 7 М мочевиной и 400 мМ NaCl. Фракции, содержащие гибридный белок, диализуют при 4-8оС в течение 18 ч против 100 объемов 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфата рН 7,2-7,4. Заменяют буфер на свежий и диализуют еще несколько часов. Белок хранят при минус 20оС. П р и м е р 4. Проверка биологической активности гибридного белка в тесте цитотоксичности на линии клеток L-929. Клетки фибросаркомы мыши L-929 выращивают на среде RPMI 1640 с добавлением до 10 сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2 мМ L-глютамина и 50 мкг/мл гентамицина (ростовая среда). Клетки помещают в виде суспензии в ростовой среде в лунки планшета из расчета 4
, патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055016/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">104 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Инкубируют планшеты при 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение ночи до образования монослоя. После инкубации удаляют среду и добавляют по 100 мкл свежей ростовой среды с 1 мкг/мл актиномицина D и двухкратными разведениями исследуемых гибридных белков. В качестве контроля используют чистый ФНО. Клетки дополнительно инкубируют в течение ночи при тех же условиях. После инкубации среду удаляют и клетки окрашивают 0,5% раствором генцианового фиолетового в течение 15 мин, после чего промывают водой и измеряют оптическую плотность. За единицу активности принимают разведение препарата, вызывающее 50% гибель клеток, учитывая исходную концентрацию гибридного белка в препарате делают перерасчет единиц активности на мг белка. Гибридный белок Т-ФНО обладает цитотоксической активностью (1-2) , патент № 2055897" SRC="/images/patents/417/2055016/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">107 ед/мг.
Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов
6 специфичный лектин - патент 2524425Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона
Класс C07K7/00 Пептиды, содержащие от 5 до 20 аминокислот с полностью определенной последовательностью; их производные
