способ получения антигена вируса африканской чумы лошадей

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ ЛОШАДЕЙ, включающий выращивание вируса в чувствительной системе культивирования, очистку вируссодержащей суспензии от балластных веществ, обработку вируса инактивирующим средством, отличающийся тем, что в качестве инактивирующего средства используют метиленбисморфолин, который добавляют в вируссодержащую суспензию в конечной концентрации 0,1 - 0,2% и полученную смесь инкубируют при 36 - 38^oС в течение 48 - 72 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается способов инактивации вируса африканской чумы лошадей (АЧЛ) путем его химической обработки, и может быть использовано при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики АЧЛ.

Вирус АЧЛ относится к роду Orbivirus семейства Reovirida и характеризуется значительной резистентностью к воздействию многих внешних и экспериментальных факторов, в том числе к низким температурам, обезвоживанию, протеолитическим ферментам, органическим растворителям, изменениям рН в диапазоне 6,0-10,0, нагреванию до 45^оС, некоторым химическим препаратам, широко используемым для дезинфекции различных объектов или для инактивации вирусов других семейств. Характерной особенностью болезни является массовость поражения животных, не подвергавшихся предварительной иммунизации. Резкое обострение эпизоотической ситуации по АЧЛ, отмеченное МЭБ за последнее десятилетие как в эпизоотичных по ней странах Африки, Испании, Португалии, так и в государствах СНГ, представляет собой важную проблему ветеринарной вирусологии. Актуальным в этом отношении является вопрос разработки высокоактивных и безопасных средств диагностики и специфической профилактики АЧЛ. Дело в том, что используемые в нашей стране диагностические антигены, представлены препаратами живого вируса разных серотипов порознь или в ассоциации.

Основные недостатки указанных препаратов состоят в наличии в них живого вируса, что ограничивает их использование только учреждениями, располагающими условиями для работы с возбудителями, отнесенными Международным зоосанитарным кодексом к группе А. Кроме того, вирус используемый в этих препаратах, по антигенным и другим иммунобиологическим свойствам не соответствует эпизоотическому, так как в результате длительного пассирования в организме белых мышей, а затем клеточных культурах производственные штаммы подвергались значительной модификации и изменчивости.

Сложность проблемы создания вирусных препаратов заключается в необходимости их инактивации до такого состояния, которое бы гарантировало отсутствие в них вируса АЧЛ, способного к репродукции в культуре клеток и в организме лабораторных и естественновосприимчивых животных, сохранение структуры, антигенной и иммуногенной активности инактивированного вируса.

Известны способы инактивации вируса АЧЛ воздействием на него ультрафиолетовой радиацией, длительной инкубацией вируса при температуре 25 или 32 0,5^оС, замораживанием при 25-30^оС.

Недостатки известных способов инактивации вируса АЧЛ состоят в том, что физические факторы инактивации недостаточно эффективны при работе с высококонцентрированными препаратами вируса, а химические вещества, которые взаимодействуя с вирусной частицей, вызывают либо полное окисление функциональных групп, либо ацилирование белковой молекулы, вызывая глубокие повреждения белковой оболочки вируса и, как следствие, снижение его антигенных и иммуногенных свойств. Так, формалин и гидроксиламин даже при значительных концентрациях и продолжительном взаимодействии в связи с особенностями кинетики инактивации способны надежно обезвредить препараты культурального и органного происхождения. Кроме того, под их влиянием отмечается значительное уменьшение антигенной и имунногенной активности препаратов, а также непригодность для титрования в реакции связывания комплемента, которая является основным методом лабораторной диагностики АЧЛ.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату при использовании является способ получения антигена вируса АЧЛ, включающий выращивание вируса в чувствительной системе культивирования, очистку вируссодержащей суспензии от балластных веществ, инактивацию вируса путем добавления в вируссодержащую суспензию 0,2% бетапропиолактона, инкубацию полученной смеси при 37^оС в течение 2 ч [1]

Недостатки наиболее близкого аналога состоят в том, что полученный в результате его использования антиген:

1) имеет низкую серологическую и иммуногенную активность, слабо или совсем неактивен в РСК и других реакциях и может быть использован только в качестве контрольного препарата в РПГА;

2) является лабильным при хранении и приобретает антикомплементарность в процессе инактивации;

3) не обеспечивает воспроизводимость технологического процесса из-за нестандартности, высокой токсичности и нестабильности инактиванта вследствие быстрого гидролиза или полимеризации с выпадением действующего начала в осадок.

Указанные недостатки обусловлены тем, что при добавлении в вируссодержащую суспензию более 2/3 бетапротиолактона гидролизуется через 30 мин при рН 7,4 уже при 22-24^оС, вызывая образование больших количеств кислых продуктов, что ведет к бесконтрольному и чрезмерному снижению рН и гидролизу вирусспецифических белков. Вследствие глубокого повреждения вирусных белков инактивированные препараты теряют иммуногенность и непригодны для иммунизации лабораторных животных-доноров специфических сывороток для диагностических целей.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способов получения антигена вируса АЧЛ, позволяющего повысить его специфическую и иммуногенную активность путем снижения деструктивных изменений белковой оболочки вируса при инактивации.

Поставленная задача решена тем, что в известном способе получения антигена вируса АЧЛ, включающем выращивание вируса в чувствительной системе культивирования, очистку вируссодержащей суспензии от балластных веществ, обработку вируса инактивирующем средством, в соответствии с изобретением в качестве инактивирующего средства используют метиленбисморфолин (МБМ), который добавляют в вируссодержащую суспензию в конечной концентрации 0,1-0,2% и полученную смесь инкубируют при 36-38^оС в течение 48-72 ч.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что в качестве инактивирующего средства используют МБМ, который добавляют в вируссодержащую суспензию в конечной концентрации 0,1-0,2% и полученную смесь инкубируют при 36-38^оС в течение 48-72 ч.

Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

МБМ представляет собой бесцветную жидкость с незначительным запахом, хорошо растворяется в воде, умеренно сдвигает величину рН в щелочную сторону. Препарат устойчив к действию щелочей, разлагается в кислой среде. Его физические свойства полностью удовлетворяют требованиям безопасности при работе. Препарат синтезирован в институте химической физики АН СССР для изучения мутагенной активности [2]

В результате проведенных исследований авторами настоящего изобретения впервые установлено новое свойство МБМ проявлять инактивирующую активность к вирусу АЧЛ, не вызывая при этом деструктивных изменений его структуры и сохраняя таким образом его исходную иммуногенную и серологическую активность.

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается технический результат, указанный в задаче создания изобретения.

П р и м е р 1. В 1,5 л матрасы с монослойной культурой клеток ППК после удаления ростовой среды вносят по 20 мл культурального матричного вируса с активностью не менее 5,0 лог ТЦД₅₀/мл в разведении 1:100 и выдерживают на контакте в течение 1 ч при комнатной температуре или в термостате при (+37 1)^оС, периодически через 10-15 мин, увлажняя клетки жидкостью. По истечении времени контакта в матрасы добавляют по 150-270 мл поддерживающей среды Игла (рН 7,4-7,6) с 2% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (200 мкг/мл канамицина). Культивирование проводят в стационарном положении при (+37 1)^оС до наступления дегенерации клеток. Цитопатический эффект соответствующего вируса в культуре клеток ППК проявляется округлением пораженных клеток с последующим отделением их от поверхности стекла. После этого матрасы встряхивают для отделения от стекла уцелевших клеток и культуральную вируссодержащую жидкость замораживают при -40^оС, оттаивают при комнатной температуре и осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость проверяют в РДСК на активность и специфичность.

При проявлении антикомплементарности вирусных суспензий производят их очистку охлажденным фреоном в конечной концентрации 5% После 3-х минутного встряхивания с детергентом суспензию центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин и надосадочную жидкость инактивируют. Для этого готовят 10% раствор МБМ на стерильной бидистиллированной воде и вносят в подогретую до (37 1)^оС вирусную суспензию из расчета 1 мл на 100 мл суспензии, что соответствует его конечной концентрации 0,1% Подводят рН суспензии 0,1 Н раствором соляной кислоты до величины 7,4-8,0 и помещают на 72 ч при (37 1)^оС с периодическим перемешиванием. По истечении времени инактивации суспензию проверяют (в учетверенной дозе) на серологическую активность и остаточную вирулентность на мышатах-сосунах или монослойной культуре клеток ППК.

Инактивированный антиген концентрируют с помощью 4% ПЭГ м.м. от 6000 до 20000 Д в 35-100 раз и используют для иммунизации доноров специфических сывороток или в качестве диагностического антигена после консервирования азидом натрия 1:5000 или лиофильной сушки.

П р и м е р 2. Расплодку вируса АЧЛ соответствующего серотипа проводят так, как описано в примере 1. При наступлении ЦПД инфицированные клетки осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Осадок, содержащий детрит инфицированных клеток, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе рН 7,0-7,2 в объеме, в 50-100 раз меньшем по сравнению с объемом надосадка. После однократного замораживания при -40^оС в течение 2-18 ч и оттаивания при комнатной температуре вирусный концентрат осветляют путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 30 мин. Полученный в надосадке лизат клеток проверяют в РДСК и инактивируют при наличии специфичности и активности КС-титра в разведении не ниже 1:32. При проявлении антикомплементарности концентрат чистят охлажденным фреоном так, как описано в примере 1. С целью инактивации 10% раствор МБМ вносят в вирусный концентрат из расчета 1,5 мл на 100 мл антигена, что соответствует его конечной концентрации 0,15% С помощью 0,1 Н раствора соляной кислоты доводят рН до 7,4-8,0 и помещают в термостат (371)^оС на 48 ч. По истечении времени инактивации препарат проверяют на серологическую активность и полноту инактивации и используют так, как описано в примере

П р и м е р 3. Готовят концентрат вируса АЧЛ соответствующего серотипа так, как описано в примере 2.

10% раствор МБМ вносят в вирусный концентрат из расчета 2 мл на 100 мл препарата, что соответствует его конечной концентрации 0,2% доводят 0,1 Н раствором соляной кислоты рН до 7,4-8,0 и помещают в термостат (37 1)^оС на 24 ч. Остальные манипуляции проводят так, как описано в примере 1, и используют для иммунизации продуцентов диагностических сывороток или в качестве диагностического антигена.

П р и м е р 4. Из матричного штамма мозгового вируса АЧЛ готовят на стерильном фосфатно-солевом растворе рН 7,4-7,6 10% суспензию, которую осветляют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочная жидкость после добавления антибиотиков служит материалом для заражения мышат-сосунов 4-6 дневного возраста в головной мозг в дозе 0,025 мл.

Мышат, погибших в течение первых 24 ч после введения вируса, уничтожают. Специфические признаки заболевания появляются через 48-96 ч и характеризуются угнетением, вялостью мышат, затем парезами и параличами различных частей тела. Для получения инфицированного мозга используют животных с ярко выраженными клиническими признаками, находящихся в предагональном состоянии, а также неповрежденные трупы мышат не позднее, чем через час после гибели. Мозг извлекают асептически и готовят 20% суспензию на стерильном физиологическом растворе рН 7,0-7,2, которую замораживают-оттаивают при комнатной температуре и осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость проверяют в РДСК на серологическую активность и при наличии КС-титра в разведении 1:16 и выше инактивируют. При проявлении антикомплементарности мозговые вирусные суспензии чистят охлажденным фреоном так, как описано в примере 1. Для инактивации в мозговые суспензии вносят 10% раствор МБМ из расчета 1,5 мл на 100 мл антигена, что соответствует его конечной концентрации 0,15% У мозговых суспензий после добавления инактиванта величина рН обычно остается в пределах нормы (7,5-8,0) и поэтому доводить ее с помощью соляной кислоты необязательно. Препарат помещают в термостат (37 1)^оС на 48 ч и после истечения времени инактивации проверяют на серологическую активность и полноту инактивации так, как описано в примере 1. Авирулентные суспензии с титром в РДСК 1:8 и выше консервируют с помощью азида натрия (1:5000). В таком виде или после лиофилизации препарат может быть использован в качестве диагностического или иммунизирующего антигена.

П р и м е р 5. Легкие и селезенку павшей от АЧЛ лошади мелко измельчают ножницами, готовят с помощью гомогенизатора 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе рН 7,0-7,2. Суспензию осветляют путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость замораживают при -40^оС и оттаивают при комнатной температуре. Суспензию чистят охлажденным фреоном (5%) и 10% раствором полиэтиленимина (добавляют до конечной концентрации 1%) и снова центрифугируют при аналогичном режиме. Надосадочную жидкость проверяют в РДСК на серологическую активность. КС-титр должен быть в разведении 1: 16 и выше и при наличии специфичности инактивируют. Для этого 10% раствор МБМ вносят в суспензию из расчета 1,5 мл на 100 мл препарата, что соответствует его конечной концентрации 0,15% Инактивированный препарат помещают в термостат (371)^оС на 48 ч и по истечении времени его проверяют на серологическую активность и полноту инактивации так, как описано в примере 1. Авирулентные суспензии с титром в РДСК 1:8 и выше консервируют с помощью азида натрия (1:5000). В таком виде или после лиофилизации препарат может быть использован в качестве диагностического антигена.

Эффективность предлагаемого способа в сравнении с прототипом подтверждена результатами многочисленных экспериментов, сведения о которых представлены ниже.

Вирулицидную активность МБМ изучали на препаратах вируса АЧЛ серотипов 1,5 и 6, полученных из коллекции Всесоюзного НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (г. Покров Владимирской обл.)

МБМ вносили в 35-кратные концентрации вируса, репродуцированного в культуре клеток перевиваемых линий 10% суспензии головного мозга белых мышат или паренхиматозных органов лошадей, зараженных вирусом АЧЛ, с титром инфекционности от 10^6,0 до 10^8,5 ЛД₅₀/мл и активных в РДСК с гомологичной сывороткой в разведениях 1:32-1:64 до конечной концентрации 0,0125% 0,025% 0,05% 0,1% 0,2% и 0,3% Для более точной дозировки инактиванта предварительно готовили его 10% раствор на стерильной бидистиллированной воде. Сразу же после добавления инактиванта рН суспензии подводили до 7,2-7,6 с помощью 0,1 Н раствора соляной кислоты. Смеси оставляли при (37 1)^оС в термостате на 24-96 ч. На обусловленный схемой опыта момент отбирали пробы для определения серологической активности и остаточной вирулентности. Серологическую активность определяли титрованием пробы в РДСК, а остаточную вирулентность титрованием на белых мышатах 4-6 дневного возраста, которым исследуемый материал вводили интрацеребрально в дозе 0,025 мл. Через час проводили осмотр мышат, павших собирали и уничтожали, а за остальными наблюдали в течение 7 дней и в случае появления гибели мышат проводили дополнительно 1-2 пасажа. Для подтверждения специфичность падежа суспензии головного мозга проверяли в РДСК с набором типоспецифических и нормальных сывороток лошадей, гипериммунизированных вирусом АЧЛ.

Параллельно с мышатами для титрования проб использовали флаконы с монослойной культурой клеток перевиваемой линии ППК. В обоих случаях по формуле Кербера-Ашмарина высчитывали концентрацию инактиванта, защищающую от поражения вирусом 50% зараженных животных или флаконов с культурой клеток (К₅₀).

Опыты показали, что при указанных параметрах К₅₀ инактиванта через 24 ч лежит в диапазоне 0,0125-0,025% при инактивации вируса из головного мозга инфицированных мышат-сосунов и 0,05% 35-кратного концентрата культуральной суспензии. Через 48 ч К₅₀ культуральных концентратов, мозговых и органных суспензий вируса не превышала 0,025% Результаты исследований приведены в табл.1.

Через 72 ч К₅₀ уменьшалась до 0,0125% и в последующие сутки значение этого показателя не изменилось.

Полную инактивацию вируса через 48 ч наблюдали при использовании МБМ в концентрации 0,2% а через 72 ч 0,1-0,2% Кривая инактивации соответствовала реакции первого порядка, поскольку наблюдалась линейная зависимость степени снижения титра инфекционности от дозы инактиванта.

При добавлении инактиванта МБМ к вирусу АЧЛ в концентрации, меньшей 0,1% не происходила полная инактивация в течение 48-72 ч, а при концентрации, превышающей 0,2% наблюдали повышение антикомплементарности антигенов.

Исследование полностью инактивированных препаратов показало, что их серологическая активность в РДСК под влиянием МБМ несколько снижается по сравнению с исходными. Однако, даже при самом жестком режиме инактивации его снижение не превышало 2,0 лог₂. В случаях же с препаратами, инактивированными в течение 48 ч 0,15% МБМ, снижение этой активности не превышало 50% Это свидетельствует об умеренном влиянии инактиванта на морфологическую целостность вирионов и о незначительных конформационных изменениях антигенных эпитопов (сайтов), расположенных на поверхности их белковой оболочки (капсида).

Результаты оценки инактивации вируса АЧЛ предлагаемым способом в сравнении с прототипом приведены в табл.2.

Из данных этой таблицы видно, что при инактивации вируса бетапропиолактоном (способ-прототип) получаемый диагностический антиген в 3-4 раза уступает по специфической активности препарату, полученному согласно предлагаемому способу.

Иммуногенную активность 35-кратного концентрата вируса АЧЛ, инактивированного 0,15% метиленбисморфолина, определяли косвенным методом на морских свинках. С этой целью одну их группу прививали внутримышечно исходным концентратом вируса в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда, а две других препаратами, инактивированными МБМ и бетапропиолактоном. Спустя 21 день иммунизацию животных повторяли, а через 10 дней обескровливали и определяли титры вирусспецифических антител в РДСК, по величине которых судили о влиянии инактивации на иммуногенную активность вируса АЧЛ.

Результаты исследования приведены в табл.3.

Из данных этой таблицы видно, что титры специфических антител в сыворотке крови морских свинок, привитых исходным концентратом вируса и препаратом, инактивированным МБМ, оказались одинаковыми. В это же время титры антител у свинок, привитых препаратом, инактивированным бетапропиолактоном, оказались минимальными и уступали в 8 раз титрам двух предыдущих групп.

Таким образом, авторами предложен способ получения антигена вируса АЧЛ, обеспечивающий изготовление полностью авирулентных, безопасных в ветеринарно-санитарном отношении препаратов, пригодных для практического применения в качестве диагностических и иммунизирующих антигенов.

В случае необходимости полученные предлагаемым способом антигены могут найти применение при изготовлении препарата для специфической профилактики АЧЛ.

Преимущество предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом заключается в том, что использование МБМ открывает практическую возможность производства высокоактивных вакцинных и диагностических антигенных препаратов без дополнительных материальных затрат на обеспечение безопасных условий их изготовления, хранения и практического применения. Проверка вирулицидной активности МБМ показала, что он надежно инактивирует вирус АЧЛ всех серотипов с незначительным снижением их серологической активности. По специфической и иммуногенной активности антигены вируса АЧЛ, инактивированные МБМ, сопоставимы с образцами живого вируса, но значительно превосходят антигены, полученные способом-прототипом.