способ выявления вируса гриппа

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА, включающий сорбцию антигена на твердую фазу, отмывание избытка антигена раствором, содержащим забуферный физиологический раствор и детергент, внесение иимунопероксидазного конъюгата, добавление субстрата с последующей инкубацией и регистрацией интенсивности окрашивания смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, раствор для отмывания содержит в качестве детергента дезинтегрон-О при следующем соотношении компонентов, %:

Забуферненный физиологический раствор NaCl с рН 7,3 - 99,995

Дезинтегрон-О - 0,005

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к способам диагностики вирусных инфекций, и может быть использовано при обнаружении вирусов гриппа.

Известен ряд способов выявления вирусов гриппа, например по реакции гемагглютинации, с помощью реакций иммунодиффузии, при использовании иммунофлюоресценции или радиоиммунологического анализа. Наиболее широкое применение в последнее время получил иммуноферментный анализ (ИФА) благодаря своей чувствительности, специфичности и простоте технического исполнения. Несмотря на это, проводятся исследования, направленные на совершенствование этого метода. В частности, одним из таких направлений является повышение чувствительности реакции путем применения поверхностно-активных веществ (ПАВ), к которым относятся твин-20, нонидет Р-40 (4), лаурилсаркозин, саркозил, октилгликозид, тритон Х-100.

Однако недостатком указанных ПАВ, применяемых в ИФА является однонаправленность их действия. Например, одни препараты, такие как твин-20 и нонидет Р-40, обеспечивают только устранение неспецифических взаимодействий компонентов реакции с поверхностью твердой фазы (полистирола). Другие же препараты (лаурилсаркозин, саркозил, октилгликозид, тритон Х-100) обладают только дезинтегрирующей активностью по отношению к вирусу гриппа и не устраняют таких неспецифических взаимодействий компонентов реакции с полистиролом.

Наиболее близкими к предлагаемому способу по обнаружению антигенов вируса являются реакции ИФА с применением твина-20. Техническая суть этой реакции сводится к следующему: в лунки иммунологических планшет из полистирола вносится антиген и выдерживается в них в течение ночи. Затем лунки трижды отмывают раствором 0,05%-ного твина-20, после чего в эти же лунки добавляют специфические антитела, разведенные упомянутым промывочным раствором, и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. После этого лунки промывают, как описано выше, и вносят в них антисыворотку, конъюгированную с пероксидазой хрена, которая разводится на том же растворе. Через 1 ч инкубации лунки опорожняют, промывают и заполняют раствором субстрата к конъюгированному ферменту. Результаты реакции оцениваются по степени интенсивности окрашивания содержимого лунок.

Недостатком реакции ИФА с применением твина-20 является ее недостаточно высокий уровень чувствительности ввиду отсутствия дезинтегрирующей активности твина-20 по отношению к вирусу гриппа.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Эта цель достигается тем, что раствор для отмывки содержит в качестве детергента дезинтегрон-0 при следующем соотношении компонентов, забуференный раствор NaCl (рН 7,3) 99,995; дезинтегрон-0 0,005.

Техническая суть предлагаемого способа сводится к следующему. Вирусную суспензию вносят в лунки иммуннологических планшет и инкубируют в течение ночи. Затем планшеты 3 раза промывают буфером для отмывки, содержащим 99,995% забуференного раствора NaCl рН 7,3 и 0,005% дезинтегрона-0. После этого в лунки вносят пероксидазный конъюгат антител к антигену вируса гриппа, разведенный на упомянутом буфере. Через 1 ч инкубации при 37^оС лунки опорожняют, отмывают, как описано выше, и заполняют раствором субстрата к пероксидазе хрена. Результаты реакции учитывают по интенсивности окрашивания растворов в лунках.

Обоснованием выбора концентрации 0,005% дезинтегрона-0, предложенной для использования в реакциях ИФА, послужили следующие наблюдения: более высокие концентрации дезинтегрона-0 (0,5-0,05%), близкие к таковым прототипа, отрицательно влияют на взаимодействие антигена с антителом, т.е. ингибируют его. Очевидно, что связано с денатурирующим эффектом этого ПАВ. Ингибирующее влияние твина-20 в таких же концентрациях выражено в большей степени, чем у дезинтегрона-0. В этой связи были расширены исследования дезинтегрона-0 и излучены его свойства в диапазоне концентраций от 0,5 до 0,005% Результаты исследований сведены в табл.1.

Как вытекает из табл.1, с уменьшением концентрации дезинтегрона-0 четко прослеживается увеличение уровня чувствительности реакции ИФА по выявлению вируса гриппа. В то же время проведенные ориентировочные исследования (данные в табл.1 не вошли) показали, что применение дезинтегрона-0 в концентрациях ниже 0,005% резко снижают чувствительность реакций ИФА. Таким образом, для достижения поставленной цели оптимальной концентрацией дезинтегрона-0 является 0,005% концентрации выше являются менее эффективными.

П р и м е р 1. Обнаружение вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 в референс-препарате.

В иммунологические планшеты фирмы "Titertek" вносили по 50 мкл вирусной суспензии А (Ленинград) 385/80 (Н3N2), содержащей 5 мкг/мл общего вирусного белка, которую готовили на 50 мМ карбонатном буфере (рН 9,6). Контрольные лунки вируса не содержали. После инкубации в течение ночи при 4^оС лунки трижды промывали буфером для отмывки, представляющим собой 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,3), содержащий 150 ммоль NaCl и 0,005% де зинтенгрона-0. Затем лунки опорожняли и заполняли 50 мкл пероксидазного конъюгата антител к внутреннему антигену вируса гриппа (матриксному белку), разведенных на упомянутом буфере для отмывки. Содержимое лунок инкубировали 1 ч при 37^оС, после чего его удаляли и промывали планшету 3 раза отмывочным буфером. Аналогичным образом обрабатывались контрольные лунки. Проявление реакции осуществляли добавлением в каждую лунку 50 мкл раствора, содержащего 0,05% перекиси водорода и 0,08% о-фенилендиамина (фирма "Pharmacia") на 0,2 М фосфатно-цитратном буфере (рН 5,0). Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 50 мкл 2н. серной кислоты. Оптическую плотность измеряли на мультискане при длине волны 492 нм. Результат реакции был оценен как положительный и составил 1,118 оптических единиц.

П р и м е р 2. Выявление вируса гриппа А/Х-79 в референс-препарате.

В иммунологические планшеты фирмы "Titertek" вносили по 50 мкл суспензии вируса гриппа А/Х-79 (Н3N2), приготовленной на 50 мМ бикарбонатном буфере (рН 9,6). Контрольные лунки вируса не содержали. Дальнейшие операции осуществляли как описано в примере 1.

Результат реакции был оценен как положительный и составил 1,284 оптические единицы.

П р и м е р 3. Обнаружение вируса гриппа А(Сычуань)2/87 в референс-препарате.

В иммунологические лунки фирмы "Titertek" вносили по 50 мкл суспензии вируса гриппа А(Сычуань)2/87 (Н3N2), разведенной на бикарбонатном буфере (рН 9,6). Контрольные лунки вируса не содержали. Последующие операции осуществляли как описано в примере 1.

Результат реакции был оценен как положительный и составил 0,304 оптические единицы.

Результаты экспериментов, описанные в примерах 1-3, обработаны статиcтически и представлены в табл.1 и 2.

Аналогично представленным примерам были проведены реакции ИФА с 0,5 и 0,05% дезинтегроном-0 (по 23 реакции), которые отражены в табл.1. Параллельно осуществлялась постановка реакций ИФА, в которых вместо дезинтегрона-0 использовался твин-20. Статистически обработанные данные этих экспериментов представлены в табл. 1 и 2. Сопоставительный анализ степени выявления различных вирусов гриппа в реакциях ИФА достоверно показал, что дезинтегрон-0 в концентрации 0,005% по сравнению с твином-20 позволяет повысить чувствительность способа в 1,2-8 раз.

Существенным отличием предлагаемого способа выявления вируса гриппа является использование в растворе для отмывки в качестве детергента дезинтегрона-0 при следующем соотношении компонентов, забуференный раствор NaCl (рН 7,3) 99,995; дезинтегрон-0 0,005. Это обеспечивает значительное повышение чувствительности реакции ИФА, что достигается, по-видимому, за счет дезинтегрирующей способности дезинтегрона-0 и отсутствия с его стороны препятствий для взаимодействия антигена и антитела.

Таким образом, положительный эффект, достигаемый в результате применения предлагаемого способа, заключается в том, что он обеспечивает повышение чувствительности иммуноферментной реакции в среднем в 4 раза, а также снижение рабочей концентрации ПАВ в растворах для отмывки иммунологических планшет в 10 раз по сравнению с прототипом.