способ получения пленки

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛЕНКИ нанесением на поверхность водной субфазы системы, состоящей из связанного с поверхностно-активным веществом гидрофильного белка и органического растворителя, формированием пленки Ленгмюровским методом при поджимании барьером до ее конденсированного состояния и стабилизацией, отличающийся тем, что на поверхность субфазы наносят белок, включенный в водные пузырьки обращенной микроэмульсии поверхностно-активного вещества в органическом растворителе, а формирование пленки осуществляют при неоднократном поджимании барьера и возвращении его в начальное положение.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области получения тонкопленочных покрытий, в частности пленок из гидрофильных белков в ленгмюровской ванне, и может быть использовано в молекулярной электронике, оптоэлектронике, производстве биологических сенсоров.

Известные способы получения пленки из гидрофильных белков в ленгмюровской ванне основаны либо на нанесении на поверхность субфазы водного раствора белка, либо на электростатическом связывании растворенного в субфазе белка с предварительно сформированным монослоем [1]

Недостатком этих способов является высокая растворимость гидрофильных белков в водной субфазе, что приводит к большому расходу дефицитного материала. Кроме того, белок частично или полностью денатурируется при растекании по границе раздела фаз, а получаемые монокомпонентные пленки оказываются слабо упорядоченными.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому способу являются способ получения пленки из гидрофильного белка в ленгмюровской ванне [2] включающий обработку белка в водном растворе поверхностно-активными веществами (ПАВ), электростатически связывающимися с полярными группами белка и переводящими его в осадок. Были использованы ПАВ с катионными, анионными и неионогенными полярными группами. Водные растворы белка и ПАВ смешивали, инкубировали в течение дня при 4^оС, полученный осадок лиофилизировали. Весовой выход комплекса белка с ПАВ в случае катионного детергента составлял 84% причем из них белок составлял 24% Для неионогенного и анионного ПАВ образования комплекса практически не происходило. Этот факт свидетельствует об определяющей роли электростатических взаимодействий между белковой глобулой и молекулами ПАВ при связывании белка с ПАВ. Полученный осадок затем растворяется в органическом растворителе и наносится для образования комплекса. Комплекс белка с катионным ПАВ содержал 150-250 молекул ПАВ на одну молекулу белка, что в принципе достаточно для образования микрокапсулы из молекул ПАВ, способной покрыть поверхность глобулы. Лиофилизованный комплекс белка с ПАВ растворяли в органическом растворителе и наносили на поверхность субфазы в ленгмюровской ванне.

Недостатком прототипа является его разработанность и апробированность только для конкретного белка глюкозооксидазы. В случае других белков осаждение ПАВ и последующее растворение в органическом растворителе не всегда возможно и может приводить к необратимой денатурации белка.

Изобретением решается задача увеличения стабильности и упорядоченности структуры пленки из гидрофильного белка путем предварительной солюбилизации (включения) белковой глобулы в водные пузырьки обращенной микроэмульсии.

Принципы солюбилизации белков в обращенных микроэмульсиях ПАВ в органических растворителях в настоящее время отработаны [3] и позволяют сохранить нативную структуру и активность белка в неполярных средах. На фиг. 1 изображена схема, иллюстрирующая включение белковой молекулы в водный пузырек обращенной микроэмульсии на примере микроэмульсии Аэрозоля ОТ. Подобное микрокапсулирование способно предохранить белок как от денатурации органическим растворителем, так и от механических напряжений, возникающих при растекании препарата по границе раздела фаз в ленгмюровской ванне. Важной особенностью обращенных микроэмульсий детергентов в органических растворителях является их лабильность и способность быстро перестраивать структуру микроэмульсионного пузырька при изменении внешних условий [4]

Способ получения пленки в ленгмюровской ванне осуществляется следующим образом. Микроэмульсию ПАВ с включенным белком наносят на поверхность водной субфазы. После растекания образца по поверхности лабильные пузырьки микроэмульсии разрушаются и избыток ПАВ переходит в водную субфазу. На поверхности воды остаются в основном пузырьки микроэмульсии, нагруженные белком, так как солюбилизованный белок, электростатически связавшийся с поверхностью микроэмульсионного пузырька, слабо растворяется в воде вследствие большей гидрофобности агрегата. Установление равновесия между веществами в пленке и в объеме субфазы существенно ускоряется при неоднократном поджимании пленки барьером ванны и отводе его в исходное положение, так как при повышенном давлении в пленке, создаваемом поджатым барьером, растворимость избытка ПАВ в воде возрастает, а поступательное движение барьера способствует быстрой структурной перестройке пленки. После сжатия пленки до конденсированного состояния, которому соответствует поверхностное давление 35 мН/м, пленку необходимо выдержать в данном состоянии не менее 20 мин, для завершения процесса структурной перестройки.

Существенные признаки, указанные в отличительной части формулы изобретения, не обнаружены ни в каких других отраслях науки, техники и промышленности, что позволяет считать предлагаемый способ соответствующим критерию "новизна".

На фиг. 1 изображены схема водного пузырька микроэмульсии с включенным водорастворимым белком на примере Аэрозоля ОТ и структурная формула последнего; на фиг. 2 изображена предполагаемая структура пленки, состоящей из белка и ПАВ, образующейся сразу после нанесения микроэмульсии на поверхность субфазы (а), после установления равновесия между веществами в пленке и субфазе (б), на твердой подложке по данным малоуглового рентгеновского рассеяния (в); на фиг. 3 и 4 изображены соответственно типичная рентгенограмма и спектр поглощения многослойной пленки на твердой подложке.

Пример конкретного способа.

К 1 мл микроэмульсии аэрозоля ОТ в гептане концентрацией 0,1 моль/л добавляли 100 мк водного раствора белка цитохрома С с концентрацией 0,1 ммоль/л и встряхивали до прояснивания микроэмульсии. 10 мкл полученной микроэмульсии с солюбилизованным белком наносили в ленгмюровской ванне на поверхность субфазы с рН 7 при комнатной температуре. Работу производили на установке KSV 5000. Неоднократным поджиманием барьера и отодвиганием его в начальное положение добивались структурной организации пленки, подобной показанной на фиг. 2б. Такая структура могла быть получена при сжатии пленки до 35 мН/м и выдерживания ее в этих условиях не менее 20 мин. За это время перестройка структуры пленки заканчивалась, после чего пленка переносилась на кварцевую подложку, предварительно покpытую монослоем арахиновой кислоты.

При переносе пленки методом вертикального лифта коэффициент переноса составлял при движении подложки снизу вверх и сверху вниз соответственно 0,95-0,05 и менее 0,2. На гидрофобную подложку пленка также хорошо переносилась методом Шефера. Включение белка в пленку и перенесение ее на подложку контролировали по спектрам поглощения цитохрома С на спектрофотометре Shimadzu (фиг. 4).

Структуру полученных пленок исследовали на малоугловом рентгеновском дифрактометре с позиционно-чувствительным детектором в геометрии качания. Точность определения углового положения рефлексов составляла 0,2 по 20.

На основании приведенных спектров малоуглового рентгеноструктурного рассеяния (фиг. 3) предложена модель наиболее вероятной упаковки мультислойной пленки белка с ПАВ на твердой подложке (фиг. 2в).

Существенным преимуществом предложенного метода по сравнению с прототипом является возможность формировать пленки в ленгмюровской ванне из широкого круга водорастворимых белков и низкомолекулярных веществ, предварительно солюбилизуя их в обращенных микроэмульсиях ПАВ в органических растворителях. Такие пленки обладают хорошо упорядоченной структурой (что видно по четко выраженным рефлексам в спектрах малоуглового рентгеновского расстояния, приведенным на фиг. 3). Кроме того, пленки имеют высокую стабильность, позволяющую переносить как минимум десятки монослоев на твердую подложку.

Метод позволяет использовать в работе весьма малые количества белкового материала, поскольку растворимость последнего в водной фазе уменьшается. По оценкам, основанным на анализе спектра поглощения пленки цитохрома С, приведенного на фиг. 4, практически весь солюбилизованный микроэмульсиями белок включился в пленку.

Поскольку при растекании препарата в ленгмюровской ванне по границе раздела фаз белок заключен в микрокапсулы ПАВ (которые разрушаются, главным образом, в результате манипуляций с барьером ленгмюровской ванны), есть основания предполагать, что денатурация белка на границе раздела уменьшается или исключается.