способ получения препарата гиалуроновой кислоты

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий измельчение петушиных гребней, промывку их, экстрагирование гиалуроновой кислоты водой, отделение экстракта и выделение препарата, отличающийся тем, что промывку гребней осуществляют многократно этиловым или изопропиловым спиртом при массовом соотношении спирта и гребней (1,5 - 3,0) : 1, после чего кусочки гребней измельчают до состояния фарша, а экстрагирование проводят при температуре не выше 80^oС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для экстрагирования используют воду, содержащую 1 - 15 мас.% хлорида натрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения препарата гиалуроновой кислоты, относящейся к классу гликозаминогликанов, которая применяется при производстве парфюмерно-косметических изделий, а также может быть использована в качестве основы при получении высокоочищенного препарата для медицины и в качестве субстрата при количественном определении ферментов гиалуронидазного действия.

Известен способ получения препарата гиалуроновой кислоты высокой степени очистки для использования в глазной и суставной хирургии, при зарубцевании ран (1).

Технология получения этого препарата сложна и трудоемка, а сам препарат является очень дорогим в силу высокой стоимости его очистки.

Кроме того, имеется ряд патентов на способы получения гиалуроновой кислоты, которая может быть применима в парфюмерно-косметических изделиях и которой не требуется высокая чистота. Однако эти способы также довольно сложны и включают ряд операций, связанных с очисткой препарата.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата гиалуроновой кислоты путем обескровливания петушиных гребней, измельчения их, экстракции водой, термообработки экстракта при 90-100^оС в течение 1-2 мин, охлаждение экстракционной массы до 4-6^оС в течение 2-4 ч, отделения липидов, фильтрации массы и отделения осадка сырья. Очистку фильтрата и выделение препарата осуществляют введением активированного угля в количестве 1-2% от массы исходного сырья, перемешиванием массы 1-2 ч и фильтрованием ее, а затем смешиванием полученного фильтрата с осадком сырья и двухстадийной экстракцией его водой в течение 18-24 ч при 20-22^оС в присутствии пенициллина в количестве 0,05-0,07% от массы исходного сырья с последующей сушкой экстракта (2).

Многоступенчатость этого способа создаст сложности при его реализации на производстве. Кроме того, применение пенициллина может повлечь за собой аллергентное воздействие препарата.

Предлагаемый способ технологически проще и позволяет получить препарат, не обладающий аллергентными свойствами.

Способ в соответствии с изобретением, включает измельчение куриных гребней, промывку их, экстрагирование гиалуроновой кислоты водой, отделение экстракта и выделение препарата, при этом промывку гребней осуществляют многократно этиловым или изопропиловым спиртом при массовом соотношении спирта и гребней 1:1,5-3,0, после чего кусочки гребней измельчают до состояния фарша, а экстрагирование проводят при температуре не выше 80^оС. Для экстрагирования может быть использована вода, содержащая 1-15 мас. хлорида натрия.

Препарат получают следующим образом.

Петушиные гребни с обрезанными окончаниями промывают холодной водой для удаления крови, в которой определяется различные белки и низкомолекулярные вещества. Кроме того, в крови содержится фермент гиалуронидаза, деполимеризующий гиалуроновую кислоту. Окончательное обескровливание, инактивация гиалуронидаза и удаление липидов осуществляется промывкой нарезанных на кусочки гребней этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении к весу сырья 1: 1,5-3,0. Промывка может быть повторена несколько раз, но не менее двух. Обработка гребней спиртом позволяет исключить использование бактериостатического агента. После обработки спиртом гребни измельчают до состояния фарша, но не гомогенизируют, и проводят экстракцию гиалуроновой кислоты дистиллированной или деионизированной водой, или 1-15%-ным водным раствором хлорида натрия. При этом соотношение массы сырья воды должно составлять от 1:3 до 1: 5. Экстракцию проводят при помощи шейкера в течение 18 ч при температуре не выше 80^оС. При использовании различных видов мешалок время экстракции можно варьировать.

Препарат гиалуроновой кислоты из экстракта осаждают спиртом или ацетоном, или лиофильно сушат.

Проведенное экспериментальное изучение препарата гиалуроновой кислоты показало, что препарат является безвредным и относится к VI классу токсичности по классификации К.К.Сидорова, ее ДЛ₅₀ более 3,1 г/кг массы белых беспородных мышей при внутрибрюшинном способе введения.

Водно-масляная эмульсия, содержащая 0,1% и 0,3% экстракта препарата, не оказывала общетоксического воздействия на организм крыс, о чем свидетельствовали результаты сравнительного анализа поведения, прибавки веса, состояния внутренних органов кожи опытных и контрольных групп.

Препарат в изученных концентрациях не вызывал раздражающего и аллергизирующего действия при его накожном применении (30 аппликаций).

Морфологические исследования не показали патологических изменений в структуре кожи и печени экспериментальных животных под влиянием применения препарата.

Биохимические исследования показали, что препарат в 0,3% концентрации увеличивал содержание суммарных липидов на 11% уровень общих растворимых белков на 8%

Гистологическая экспертиза опытных биоптатов кожи (0,3%-ная концентрация препарата) свидетельствовала об его увлажняющем действии.

Предлагаемый препарат гиалуроновой кислоты рекомендуется для введения в косметические средства для ухода за сухой и увядающей кожей. Благодаря меньшему содержанию белка он также может найти более широкое применение в косметической промышленности, в частности его можно вводить в лосьоны, губные помады и т.д.

Количество используемого при промывке спирта не может быть менее чем 1,5 объема по отношению к весу сырья, так как в противном случае гребешки не будут полностью закрыты жидкостью. Использование свыше 3-х объемов спирта нецелесообразно из-за большого расхода спирта при незначительном улучшении качества.

При водной экстракции использование менее 3-х объемов воды по отношению к весу сырья приведет к получению очень вязкого раствора и вследствие этого к высоким потерям экстракта при отделении экстракта и низкому выходу конечного продукта. Использование свыше 5-ти объемов воды при экстрагировании приводит к большим энергозатратам при лиофилизации экстракта или требует большого объема спирта при переосаждении при незначительном увеличении выхода.

При повышении температуры экстракционной смеси выше 80^оС может происходить частичная деполимеризация гиалуроновой кислоты и уменьшение вязкости получаемых растворов.

П р и м е р 1. У петухов в возрасте 15 месяцев после обескровливания и шпарки срезают гребни, промывают холодной водопроводной водой до исчезновения красной окраски и разрезают на кусочки размером не более 10 мм.

250 г нарезанных гребней заливают 375 мл 96%-ного этилового спирта и перемешивают в течение 6 ч. Спирт сливают и повторяют промывку с новой порцией спирта в течение 18 ч. После перемешивания спирт сливают гребни измельчают до состояния фарша, но не гомогенизируют. К измельченному сырью добавляют 750 мл дистиллированной воды (соотношение 1:3) и проводят экстракцию при постоянном перемешивании в течение 18 ч при 60^оС. Экстракт препарата центрифугируют и центрифугат лиофилизируют. Получают 4,75 г препарата гиалуроновой кислоты (выход 1,92% к массе исходного сырья). Препарат представляет собой волокнистое вещество белого цвета, содержание белка 9% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,3 сСт, оптическая плотность при 540 мм 0,10.

П р и м е р 2. Получение препарата проводят аналогично примеру 1, используя в качестве экстрагирующей жидкости 10%-ный водный раствор хлорида натрия, а выделение продукта из раствора осуществляли переосаждением 4 мл объемами этилового спирта.

Получен порошок белого цвета, выход 1,88% содержание белка 8% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 5,9 сСт, оптическая плотность при 540 мм 0,09.

П р и м е р 3. Выделение препарата проводят как в примере 1, используя при экстрагировании 4 объема дистиллированной воды по отношению к исходному весу сырья.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,11% содержание белка 14% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,0 сСт, оптическая плотность при 540 мм 0,10.

П р и м е р 4. Выделение препарата проводят как в примере 1, используя при экстрагировании 5 объемов дистиллированной воды по отношению к весу сырья.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,15% содержание белка 18% кинематическая вязкость 0,1-ного водного раствора 6,2 сСт, оптическая плотность при 540 мм 0,11.

П р и м е р 5. Выделение препарата проводят как в примере 3, используя для промывки 3 объема изопропилового спирта по отношению к исходному весу сырья.

Получено волокнистое вещество белого цвета со слабым кремоватым оттенком, выход 1,94% содержание белка 15% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,2 сСт, оптическая плотность при 540 мм 0,13.

П р и м е р 6. Выделение препарата проводят как в примере 3, при этом температура экстрагирования 80^оС.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,12% содержание белка 24% кинематическая вязкость 0,1% -ного водного раствора 5,7 сСт, оптическая плотность при 540 мм равна 0,14.