способ исследования фагоцитоза в цельной крови

Формула изобретения

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОЦИТОЗА В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, включающий инкубацию смешанной с объектами фагоцитоза крови, приготовление мазка на предметном стекле с последующей его фиксацией, окраской и микроскопическим определением объектов фагоцитоза, заключенных в фагоциты крови, отличающийся тем, что предварительно перед инкубацией крови с объектами фагоцитоза каплю крови помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере при 37^oС для разделения крови на плазменный слой, содержащий лейкоциты и лейкоцитарный слой, лежащий на эритроцитах, и наслаивают взвесь объектов фагоцитоза, а перемешивание крови с объектами фагоцитоза осуществляют перед приготовлением мазка.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для анализа поглотительной активности фагоцитов в цельной крови у здоровых лиц и для выявления людей и животных с недостаточностью фагоцитоза.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов в мазках крови остается одним из самых распространенных и простых методов оценки антимикробной резистентности организма. Существует мнение о возможности доведения ошибки этого теста (коэффициент вариации в параллельных исследованиях) до 6,5% Эти данные несомненно свидетельствуют о его достаточной воспроизводимости, о возможности его дальнейшего совершенствования и возможности широкого использования для выявления недостаточности поглотительной функции нейтрофилов.

Прототипом изобретения является способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов в цельной крови. При постановке этого метода кровь и объекты фагоцитоза (ОФ) инкубируют в пробирке в условиях периодического встряхивания. Каплю смеси переносят на предметное стекло, готовят мазок, фиксируют, окрашивают по Романовскому, микроскопически определяют количество ОФ, заключенных в нейтрофилы крови. Однако при взаимодействии крови и ОФ в пробирке существует возможность прилипания наиболее активных фагоцитов к стеклу, поэтому в дальнейшем их поглотительную активность не учитывают. Силиконирование поверхности стекла, которое обычно используют для предотвращения прилипания фагоцитов к стеклу, не отменяет этот процесс. При постановке известного способа осуществляют встряхивание реагирующих компонентов для равномерного распределения ОФ между клетками крови и ее плазменной частью. Однако известно, что до 75% микробных корпускул, внесенных в кровь, фиксируется эритроцитами. Эритроциты экранируют антигенные сайты ОФ, уменьшают их доступность для фагоцитов крови, поэтому уровни фагоцитоза существенно снижаются при добавлении к лейкоконцентратам аутологичных эритроцитов. Представленные недостатки прототипа приводят к снижению информативности, чувствительности и точности микроскопического определения поглотительной активности фагоцитов в цельной крови.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности определения фагоцитоза в цельной крови.

Это достигается тем, что каплю крови обследуемого помещают на поверхность предметного стекла, инкубируют во влажной камере для разделения крови на верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты, и лейкоцитарный слой, лежащий на эритроцитах. После этого наслаивают суспензию ОФ, инкубируют во влажной камере, перемешивание крови и ОФ осуществляют перед приготовлением мазка, который готовят на этом же стекле, фиксируют в метаноле, окрашивают по Романовскому и микроскопически определяют ОФ, поглощенные нейтрофилами крови.

Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии Пермского медицинского института в г.Перми и на той же кафедре филиала Пермского медицинского института в г.Кирове. Обследовано 12 здоровых доноров-людей, 34 больных с воспалительными заболевания системы мочеотделения, 10 больных с урологическими заболеваниями, осложненными хронической почечной недостаточностью (ХПН). 30 свиней (18 животных контрольная группа, 12 животных с воспалительными заболеваниями легких).

Для выполнения предлагаемого способа кровь от обследуемых помещают в пробирки однократного применения или в стеклянные пробирки с силиконированной внутренней поверхностью, стабилизируют гепарином (20-50 ед/мл), до исследования хранят при температуре 4^оС не более 2 часов. В качестве ОФ используют корпускулярный антигенный эритроцитарный диагностикум к шигеллам Зонне (предприятие по производству бактерийных препаратов Ленинградского научно-ис- следовательского института вакцин и сывороток). Для приготовления суспензии ОФ ампулу сухого антигенного эритроцитарного диагностикума растворяют в 10 мл среды 199 или раствора Хенкса и дважды отмывают в 10 мл среды путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Центрифугат ресуспендируют в 1 мл культуральной среды, для осаждения коагулировавших ОФ помещают в термостат на 20 мин при 37^оС, берут 0,7 мл надосадочной жидкости и доводят концентрацию антигенных корпускул до 50-200 тыс. в 1 мкл.

Пять микролитров крови помещают на предметное стекло, куда для создания оптимальных условий предварительно наносят такое же количество культуральной среды. Инкубируют 30 мин при 37^оС во влажной камере для разделения крови на слой плазмы, содержащий лейкоциты, и слой лейкоцитов, лежащий на эритроцитах. Наслаивают 5 мкл суспензии ОФ. Инкубируют во влажной камере при 37^оС в течение 10-20 мин, с помощью шлифовального стекла осторожно перемешивают смесь и готовят мазки, фиксируют в метаноле и окрашивают по Романовскому.

Для получения влажной камеры в чашку Петри помещают диск из фильтровальной бумаги размером, равным площади чашки, наливают 2 мл дистиллированной воды. Влажные камеры прогревают 1 ч при 37^оС, стекла и культуральную среду 30 мин при 37^оС.

Новизна заявляемого способа состоит в том, что исследуемую кровь помещают на предметное стекло, на котором производят все этапы постановки метода, что существенно увеличивает точность определения поглотительной функции нейтрофилов крови, поскольку отсутствует потеря наиболее "активных" фагоцитов из-за их адгезии на стенке пробирки. Наслаивание суспензии ОФ осуществляют на образец крови, разделенный на плазменный слой, содержащий фагоциты, и лейкоцитарный слой, расположенный на эритроцитах. Для нейтрофилов создаются условия для непосредственного взаимодействия с ОФ, снижается экранирующая роль эритроцитов, что также способствует увеличению точности определения поглотительной активности фагоцитов.

П р и м е р 1. Исследование влияния пола на фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) цельной крови у здоровых доноров.

Исследование проведено c венозной кровью здоровых доноров (мужчин и женщин). ФАН в цельной крови определяли с помощью заявляемого способа и двух вариантов прототипа. Для осуществления общепринятого метода кровь и ОФ смешивали в пробирках однократного применения в соотношении 1:1 (прототип 1). Параллельно готовили пробу, где в пробирку предварительно добавляли 0,1 мл среды 199, а затем 0,1 мл крови испытуемого, после чего инкубировали 30 мин при 37^оС (прототип 2). В последней пробе создавали разведение крови, соответствующее заявляемому способу. Добавляли 0,1 мл суспензии ОФ. Дальнейший контакт осуществляли в течение 20 мин при 37^оС, каждые 5 мин пробирки встряхивали. После инкубации в термостате 15 мкл смеси наносили на предметное стекло, готовили мазки, фиксировали в метиловом спирте, окрашивали по Романовскому, определяли ФАН.

Уровень ФАН оценивали на основании определения фагоцитарного числа (ФЧ), процента фагоцитоза (%Ф), фагоцитарного индекса (ФИ). Фагоцитарное число это среднее количество ОФ, приходящееся на 1 из 100 учтенных нейтрофилов. Процент фагоцитоза это количество нейтрофилов, поглотивших ОФ, на 100 учтенных нейтрофилов. Фагоцитарный индекс это среднее количество ОФ, приходящееся на 1 нейтрофил, участвующий в фагоцитарном акте.

Результаты исследования представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, выявлены более высокие уровни ФАН у женщин по сравнению с мужчинами. Важно отметить, что эта закономерность определяется только при использовании заявляемого способа. Применение прототипа не позволяет выявить данное различие. Представленные результаты свидетельствуют о возможности выявления физиологических особенностей фагоцитарного процесса у здоровых людей с помощью заявляемого способа.

П р и м е р 2. Исследование влияния хронической почечной недостаточности и возраста на фагоцитарную активность нейтрофилов у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения.

Изучены уровни ФАН в цельной крови у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения, осложненных и неосложненных хронической почечной недостаточностью (ХПН), при использовании заявляемого способа и двух вариантов прототипа.

В табл. 2 приведены материалы исследования поглотительной активности нейтрофилов в цельной крови у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения, осложненных и неосложненных ХПН. Как видно из табл. 2, выявлено снижение фагоцитоза в цельной крови у больных с ХПН. Важно отметить, что недостаточность фагоцитарного процесса у этой группы больных удается определить только при применении заявляемого способа.

В табл. 3 представлены результаты изучения влияния возрастного фактора на фагоцитарную активность нейтрофилов у больных с урологическими заболеваниями без ХПН. Как видно из табл. 3, у больных в возрасте до 60 лет и старше не обнаружено существенных отличий фагоцитоза. Аналогичное исследование произведено с кровью больных, у которых воспалительные заболевания системы мочеоотделения были осложнены хронической почечной недостаточностью (табл. 4). Как видно из табл. 4, у этой группы больных выявлены существенно более высокие уровни фагоцитоза в возрасте до 60 лет, чем у больных более преклонного возраста. Следует отметить, что представленные выше данные о связи длительности хронической почечной недостаточности и снижения фагоцитоза удалось выявить только при использовании заявляемого способа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХПН сочетается с иммунодефицитным состоянием, проявляющемся в виде снижения поглотительной активности нейтрофилов в цельной крови. Степень снижения ФАН зависит от длительности заболевания, поскольку отмечается только у больных в возрасте 60 лет и старше. В этой группе больных фагоцитарный индекс у всех обследованных был ниже доверительного интервала от среднего показателя больных без хронической почечной недостаточности.

Проведенное испытание заявляемого метода определения фагоцитарной активности нейтрофилов крови свидетельствует о его большой чувствительности и точности при выявлении иммунодефицитных состояний, характеризующихся снижением поглотительной активности фагоцитов крови.

П р и м е р 3. Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов в цельной крови у свиней с воспалительными заболевания легких.

Произведено определение фагоцитарной активности нейтрофилов в цельной крови у свиней с целью оценки неспецифической антимикробной резистентности предлагаемым (I) и общепринятым (прототип III) способами. Исследование осуществлено у здоровых свиней (контрольная группа) и свиней, подверженных воспалительным поражениям ткани легких, которые получали в корм пищеотходы многодневного сбора.

Результаты представлены в табл. 5. Как видно из табл. 5, у животных с воспалительными заболеваниями легких выявлен более низкий уровень фагоцитарной активности нейтрофилов. Отмечено, что уровни фагоцитарной активности у всех животных подопытной группы ниже доверительного интервала среднего показателя контрольной группы (100%).

Параллельно осуществили изучение фагоцитоза общепринятым способом (III второй вариант прототипа). При постановке этого теста крови и ОФ осуществляли в пробирках с инертной поверхностью в условиях периодического встряхивания реагирующих компонентов. Как видно из табл. 5, при использовании данного способа определения ФАН не обнаружено каких-либо отличий между показателями контрольной и опытной групп свиней.

Проведенное исследование позволяет заключить, что предлагаемый способ определения фагоцитоза в цельной крови обладает более высокой точностью и информативностью, достаточной для выявления иммунодефицитных состояний, в основе которых имеет место нарушение фагоцитарной функции клеток крови. Данный способ обладает большей точностью оценки неспецифической резистентности организма, в сравнении с общепринятым тестом оценки фагоцитоза.

Таким образом, заявляемый способ определения фагоцитоза в цельной крови обладает большей чувствительностью и большей точностью определения неспецифической резистентности организма. Его использование дает возможность выявить отличия ФАН у здоровых людей, связанные с физиологическими особенностями организма, например влияние пола, а также позволяет определить иммунодефицитные состояния, проявляющиеся в виде снижения поглотительной функции нейтрофилов крови (у больных с хронической почечной недостаточностью, у свиней с воспалительными поражениями ткани легких). Последнее определяет возможность экстренных иммунокорригирующих мероприятий для предотвращения формирования и углубления воспалительных заболеваний внутренних органов инфекционного происхождения.

Заявляемый способ определения фагоцитоза в цельной крови может быть использован в больничных и научно-ис- следовательских лабораториях ветеринарного профиля, для анализа физиологических особенностей фагоцитарного процесса и для выявления иммунодефицитных состояний, сопровождающихся снижением фагоцитарной активности клеток крови.