способ диагностики инфекционной резистентности организма

Формула изобретения

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА путем выделения лимфоцитов крови, определения их пролиферативной способности, отличающийся тем, что дополнительно определяют способность лимфоцитов секретировать лимфокин, стимулирующий фагоцитоз, рассчитывают суммарную полиферативную способность лимфоцитов и при величине ее 1,4 и ниже диагностируют снижение инфекционной резистентности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано в профильных учреждениях для диагностики инфекционной резистентности организма у больных.

Известно, что защита от инфекции (инфекционная резистентность) складывается из функциональной активности нескольких систем организма: комплемента, фагоцитоза, гуморального и клеточного иммунитета. Большинство из опубликованных способов диагностики инфекционной резистентности основываются на измерении параметров сегментоядерных нейтрофилов, фагоцитарной реакции клеток.

Фагоцит, поглотивший микроорганизмы, содержащие собственную генетическую информацию, представляет собой частично чужеродную структуру антиген, против которого развивается Т-лимфоцитарный механизм иммунитета. Согласно современным данным, антиген модифицируется микрофагом и представляется антигенраспознающему Т-лимфоциту, в результате чего происходит активация и превращение Т-клеток из соответствующих предшественников в Т-хелперы, супрессоры и киллеры. Наиболее широко применяемым тестом, позволяющим количественно оценить взаимодействие между макрофагами (моноцитами) и Т-клетками в процессе пролиферации Т-лимфоцитов, в настоящее время является реакция бластной трансформации лимфоцитов, чаще всего проводимая с фитогемагглютинином и конканавалином А.

Наиболее близким к заявляемому способу является определение пролиферативной способности лимфоцитов (реакция бластной трансформации лимфоцитов). В способе показано, что резкая ФГА-гипореактивность является четким признаком бактериальной инфекции.

Недостатком способа-прототипа является установление гипореактивности лимфоцитов на фоне уже развившегося бактериального процесса. Кроме того, при использовании определения реакции бластной трансформации в ответ на митогены не учитывается активность лимфокинов, воздействующих на фагоцитарное звено.

Цель изобретения повышение точности диагностики инфекционной резистентности за счет учета общей пролиферативной способности и способности лимфоцитов секретировать фактор, воздействующий на фагоцитарное звено.

Поставленная цель достигается тем, что выделяют лимфоциты крови, определяют их пролиферативную способность в ответ на культивирование с митогенами, дополнительно определяют способность лимфоцитов секретировать лимфокин, стимулирующий фагоцитоз, рассчитывают суммарную пролиферативную способность лимфоцитов и при величине ее 1,4 и ниже диагностируют снижение инфекционной резистентности.

Способ осуществляют следующим образом.

При поступлении больного в клинику проводят забор венозной гепаринизированной крови. Далее проводили выделение лимфоцитов в градиенте плотности фиколл-урографина (d 1,076), дважды отмывали в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4), разводили средой РРМ1-1640 до концентрации 3 10⁶ клеток/мл. В качестве стимулятора использовали конканавалин А (КонА) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили нестимулированные лимфоциты крови. Культивирование проводили с раствором митогена (КонА) в течение 72 ч. Супернатанты культур получали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин.

I. После получения супернатанта осадок лимфоцитов осторожно ресуспендировали, из взвеси клеток готовили мазки, высушивали, затем окрашивали их и подсчитывали число бласттрансформированных на 100 клеток лимфоцитов. Результат выражали в условных единицах. Например, после культивировании лимфоцитов с раствором митогена в мазках крови обнаружили 40 трансформированных лимфоцитов на 100 подсчитанных клеток. Следовательно, пролиферативная способность лимфоцитов в данном случае составляла 40:100 0,4.

II. Активность секретируемых лимфокинов в супернатантах культур тестировали по степени стимуляции НСТ-теста в лейкоконцентратах гепаринизированной крови здоровых лиц. На предметном стекле смешивали по 20 мкл лейкоконцентрата, 0,2%-ный раствор нитросинего тетразолия (НСТ) и тестируемого цельного супернатанта. Стекла инкубировали во влажной камере 60 мин при 37^оС, из капли делали на этом же предметном стекле мазок, который после просушивания и фиксации метанолом докрашивали 0,2% -ным водным раствором нейтрального красного. При микроскопировании учитывали процент стимулированных нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы диформазана. Величину стимулирующего эффекта (индекс стимуляции (ИС)) рассчитывали по формуле

ИС где А показатель со стимулированными пробами;

В с контрольными супернатантами.

Например, процент нейтрофилов в контроле, содержащих гранулы диформазана, в контрольных мазках составлял 15% после стимуляции опытными супернатантами 40% Следовательно, индекс стимуляции в данном случае составлял

1,66

Суммарная пролиферативная активность составила 0,4+1,66 2,06 колебалась от 2,78 до 3,15.

Примерами конкретного осуществления способа могут служить выписки из историй болезни.

П р и м е р 1. Больная О-к поступила в гематологическое отделение по поводу хронического миелолейкоза в стадии выраженных клинических проявлений с типичными для этого заболевания клинико-гематологическими проявлениями. При поступлении проведено исследование функционального состояния лимфоцитов:

Пролиферативная способность лимфоцитов составила 0,27

Способность лимфоцитов

секретировать лимфокины, стимулирующие фагоцитоз 1,11

Суммарная пролиферативная активность лимфоцитов 1,38.

Таким образом, у данной больной можно сделать заключение о снижении инфекционной резистентности организма. Через неделю после лечения у больной на фоне снижения инфекционной резистентности развилась бронхопневмония. Следовательно, клиническое течение подтвердило данные, полученные при использовании функционального состояния лимфоцитов.

П р и м е р 2. Больной Х-ко поступил в гематологическое отделение с типичными клинико-гематологическими проявлениями хронического миелолейкоза в стадии развернутых клинических проявлений. При исследовании функциональной активности лимфоцитов получены следующие данные:

Пролиферативная активность лимфоцитов 0,38

Способность лимфоцитов

секретировать лимфокин, стимулирующий фагоцитоз 1,5

Суммарная пролиферативная активность лимфоцитов 1,88

Таким образом, можно сделать заключение, что у данного больного инфекционная резистентность организма сохранена. Клиническое течение заболевания подтвердило полученные экспериментальные данные: признаков инфекционно-воспалительных процессов не наблюдалось.

Апробация способа проведена на 74 больных хроническим миелолейкозом (как модель нарушения инфекционной резистентности организма вследствие лейкозного процесса) и 30 практически здоровых лицах (доноры).

Проведен сравнительный анализ точности диагностики инфекционной резистентности с использованием способа-прототипа и заявляемого способа. Так, при применении способа-прототипа ошибка в прогнозировании возникновения инфекционных процессов (т.е. в диагностики состояния инфекционной резистентности) наблюдалась у 22 (29,72%) больных, тогда как при использовании заявляемого способа ошибка наблюдалась у 10 (13,5%). Таким образом, точность заявляемого способа диагностики инфекционной резистентности организма была повышена в 2,2 раза.