способ оценки тяжести лейкоза

Формула изобретения

СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ЛЕЙКОЗА путем выделения лимфоцитов крови, определения их естественной цитотоксичности, отличающийся тем, что дополнительно определяют антителозависимую цитотоксичность, опосредованную лимфоцитами и нейтрофиллами, рассчитывают суммарную естественную и антителозависимую цитотоксичность клеток и при величине снижения ее относительно нормальных величин ниже 50% для острых лейкозов и хронического лимфолейкоза и ниже 40% для хронических миелопролиферативных лейкозов оценивают тяжелое течение лейкозного процесса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии.

Объективная оценка тяжести лейкозного процесса является актуальной задачей и имеет важное значение для назначения адекватной терапии. В клинической гематологической практике наиболее распространенным методом оценки тяжести лейкозного процесса является комплекс клинико-гематологических показателей: жалобы больного, количество лейкоцитов крови, состав лейкоцитарной формулы, размеры паренхиматозных органов (базовый способ). Однако в ряде случаев оценка тяжести лейкозного процесса с использованием этих показателей дает диагностические ошибки: обострение лейкозного процесса может протекать на фоне картины крови, характерной для более легкой степени тяжести, но с опухолевой метаплазией лимфатических узлов, поражением костей и паренхиматозных органов.

Наиболее близким к заявляемому способу является прогнозирование и оценка тяжести лейкозного процесса по определению активности естественных киллерных лимфоцитов крови у больных в развернутой стадии хронического лейкоза, при этом осуществляют постановку реакции естественной цитотоксичности в отношении клеток-мишеней К 562, определяют процент специфического лизиса клеток-мишеней и при его сохранении в пределах показателей естественной цитотоксичности соответствующих клеток-эффекторов и клеток-мишеней, характерных для данной стадии заболевания прогнозируют благоприятное течение заболевания, а при достоверном снижении неблагоприятное.

Однако способ-прототип имеет недостатки, так как при его использовании абсолютно не учитывается активность других цитотоксических киллерных клеток: К-лимфоцитов и нейтрофилов, которые также играют большую роль в противоопухолевой защите организма.

Технический результат изобретения повышение точности оценки тяжести лейкозного процесса за счет учета суммарной цитотоксической активности лимфоцитов и нейтрофилов крови.

Технический результат достигается тем, что из венозной крови выделяют лимфоциты и нейтрофилы, проводят определение антителозависимой цитотоксичности, опосредованной лимфоцитами и нейтрофилами, рассчитывают суммарную (естественную и антителозависимую) цитотоксичность клеток и при величине снижения ее относительно нормальных величин ниже 50% для острых и хронического лимфолейкоза и при 40% для хронических миелопролиферативных лейкозов диагностируют тяжелое течение лейкозного процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

При поступлении больного в клинику проводят забор венозной крови (гепаринизированной 50 Ед/мл). Лейкоциты крови разделяют на двойном градиенте фиколлурографина. В стерильную пробирку поочередно наслаивают раствор I (плотность 1,119 г/см³) и раствор II (плотность 1,077 г/см³) и разведенную в соотношении 1:2 кровь. Содержимое пробирок центрифугируют при 3500 об/мин в течение 30 мин. Популяции разделенных лейкоцитов (верхнее кольцо лимфоциты, нижнее нейтрофилы) отсасывают с интерфазных поверхностей и трижды отмывают средой 199. У больных хроническим миелолейкозом лимфоциты выделяют после предварительного удаления из образцов крови зрелых и созревающих миелоидных клеток.

В качестве клеток-мишеней используют клетки стандартной культивируемой линии хронического эритромиелолейкоза К 562. Клетки-эффекторы (лимфоциты) взвешивают в питательной среде до концентрации 10⁶ клеток/мл для тестирования естественной цитотоксичности и 10⁵ клеток/мл для тестирования антителозависимой цитотоксичности. В качестве клеток-мишеней при проведении антителозависимой цитотоксичности, опосредуемой нейтрофилами, используют эритроциты кур.

Определение активности естественной и антителозависимой цитотоксичности исследуют по 4-х часовой инкубации их при 37^оС, 100%-ной влажности в атмосфере 5% СО₂ с клетками-мишенями, меченными ⁵¹Cr (5):10⁶ клеток/мл для естественной цитотоксичности и 10⁵ клеток/мл для антителозависимой цитотоксичности (в течение 1 ч инкубируют с 3,7 МБк ⁵¹Cr в виде Na₂CrO₄ при 37^оС). Затем клетки-мишени трижды отмывают и ресуспендируют в конечной концентрации в среде 199. Выход изотопного маркера в культуральной среду подсчитывают в 0,1 мл супернатанта на колодезном гамма-счетчике ("Gamma", КНР). Процент цитолиза вычисляют по формуле

ЦИ 100% где ЦИ цитотоксический индекс или процент специфического лизиса клеток-мишеней;

А радиоактивность супернатанта из опытного образца;

В спонтанное освобождение изотопа в супернатант;

С максимальный выход изотопа из клеток-мишеней, который получают добавлением в соответствующие лунки неионного детергента (1% Тритон-В).

Для унификации способа соотношение клеток-эффекторов (лейкоциты) и клеток-мишеней при постановке реакции естественной и антителозависимой цитотоксичности составляло 25:1.

Параллельно исследуют цитотоксичность лейкоцитов крови у здоровых лиц. Получены следующие результаты: естественная цитотоксичность лимфоцитов колебалась от 36 до 55% (в среднем 45,5 2,4%) антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов от 17 до 39% нейтрофилов от 17 до 42% Суммарная цитотоксическая активность лейкоцитов (ЦАЛ) у здоровых лиц колебалась от 82 до 98% и у 30% здоровых лиц составила 91,4 0,71%

После определения суммарной цитотоксической активности высчитывают величину снижения ее по сравнению с нормальными показателями

1 100% и при величине этого снижения ниже 50% (при острых лейкозах и хроническом лимфолейкозе (и ниже 40%) при хронических миелопролиферативных заболеваниях) судят о тяжелом течении лейкозного процесса.

Примерами конкретного осуществления способа могут служить выписки из историй болезни. В приведенных примерах по каждой нозологической форме показатели гемо-, миелограммы, жалобы больных и субъективное состояние больных практически не отличались.

П р и м е р 1. Больная П-ко, N истории болезни 589/27 поступила в отделение по поводу хронического лимфолейкоза. Показатели цитотоксичности лейкоцитов составили: естественная цитотоксичность лимфоцитов 13,3% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 17,50, нейтрофилов 18% Таким образом, суммарная цитотоксичность лейкоцитов составила 48,8% и была ниже нормальных показателей (91,4 0,7% ) на 46,7% Течение лейкозного процесса в данном случае оставалось доброкачественным.

П р и м е р 2. Больная К-ва, N истории болезни 1142/163, поступила в гематологическое отделение по поводу хронического лимфолейкоза. При исследовании цитотоксичности получены следующие результаты: естественная цитотоксичность лимфоцитов 9,8% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 12,6% нейтрофилов 17% Суммарная цитотоксичность (39,4%) оказалась ниже нормальных величин на 56,9% В данном случае лейкозный процесс протекал злокачественно с появлением опухолевых конгломератов в брюшной полости.

П р и м е р 3. Больная Л-ко, N истории болезни 05762/248 поступила в гематологическое отделение по поводу острого лейкоза, I острого периода с характерными клинико-гематологическими проявлениями. Естественная цитотоксичность лимфоцитов составила 8,7% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 10% нейтрофилов 12% Суммарная цитотоксичность оказалась равной 30,7% и была ниже нормальных величин на 66,7% Течение лейкозного процесса в данном случае отличалось злокачественностью, клинико-гематологического улучшения после применения цитостатических препаратов не получено.

П р и м е р 4. Больной С-ко, N истории болезни 52647/22015 поступил в гематологическое отделение по поводу острого миелобластного лейкоза. Данные исследования цитотоксической функции лейкоцитов крови: естественная цитотоксичность лимфоцитов была равной 14,5% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 19% нейтрофилов 17% Суммарная цитотоксичность лейкоцитов (50,5%) была ниже нормальных на 44,8% Острый лейкоз в данном случае протекал обычно, у больного достигнуто клинико-гематологическое улучшение.

П р и м е р 5. Больной Х-ко, поступил в гематологическое отделение по поводу хронического миелолейкоза в развернутой стадии заболевания. При поступлении цитотоксическая (естественная) активность лимфоцитов составила 16,2% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 14,5% нейтрофилов 18,5% Суммарная цитотоксичность клеток оказалась равной 49,2% и была ниже нормальных величин на 46,2% Течение лейкозного процесса в данном случае отличалось агрессивностью: у больного в течение 2 месяцев развилась картина бластного криза.

П р и м е р 6. Больная О-к поступила в гематологическое отделение с клинико-гематологическими проявлениями хронического миелолейкоза в развернутой стадии заболевания. При исследовании цитотоксической функции лейкоцитов получены следующие результаты: естественная цитотоксичность лимфоцитов 17,8% антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов 18% нейтрофилов 20% суммарная цитотоксичность клеток составила 55,0% и была ниже нормальных величин на 39% После проведенного лечения состояние клинико-гематологического улучшения у больной сохранялось в течение 9 месяцев, т.е. лейкозный процесс в данном случае протекал доброкачественно.

Апробация способа проведена на 177 больных с различными формами лейкозов и 30 практически здоровых лиц (доноры). Проведен сравнительный анализ точности способа-прототипа и заявляемого способа. При применении способа-прототипа ошибка в определении тяжести лейкозного процесса была у 30 (16,9%) из 177 больных, тогда как использование заявляемого способа позволило снизить процент ошибок до 7,9% (14 из 177 больных). Таким образом, точность определения тяжести лейкозного процесса была повышена в 2,13 раза.