способ определения концентрации гемоглобина в крови и реактив для лизирования клеток крови

Формула изобретения

Способ определения концентрации гемоглобина в крови, включающий обработку разведения пробы крови лизирующим реактивом и определение концентрации гемоглобина по результатам измерения оптической плотности гемолизата, отличающийся тем, что в качестве лизирующего реактива используют реактив на основе четвертичной аммониевой соли, имеющей общую формулу строения



где R₁, R₂, R₃ - С₁ - С₄-алкил;

R₄ - С₁₂ - С₁₆-алкил;

X - галоген.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерения оптической плотности проводят в области длины волны 405 нм.

3. Реактив для лизирования клеток крови, включающий лизирующий агент, буферный агент для поддержания значения pH и воду, отличающийся тем, что в качестве лизирующего агента используется четвертичная аммониевая соль, имеющая общую формулу строения



где R₁, R₂, R₃ - короткий С₁-С₄-алкил;

R₄ - С₁₂ - С₁₆-алкил;

Х - галоген,

при содержании лизирующего агента не менее 45,6 г/л.

4. Реактив по п.3, отличающийся тем, что в нем используется четвертичная аммониевая соль с С₁₄ - С₁₆-алкильной группой.

5. Реактив по п. 3, отличающийся тем, что он дополнительно содержит неионное поверхностно-активное вещество.

6. Реактив по п.3 или 4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит антикоагулянт.

7. Реактив по п.3 или 4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит консервант.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в гематологии при проведении исследований крови.

Измерения концентраций гемоглобина и лейкоцитов в крови являются наиболее распространенными лабораторными исследованиями крови. В настоящее время определение концентрации лейкоцитов в крови производят с использованием лизирующих реактивов (гемолитиков) веществ, разрушающих эритроциты, при этом в течение времени, необходимого для измерений, в разведении крови остаются лейкоциты, концентрация которых измеряется кондуктометрическими счетчиками.

Определение концентрации гемоглобина в крови производят по результатам измерения в области определенной длины волны оптической плотности гемолизата продукта, получающегося в результате добавления гемолитика к разбавленной крови. Под действием гемолитика разрушаются эритроциты и происходит выход гемоглобина в раствор. Так как в крови содержатся различные формы гемоглобина (оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин и др. ), имеющие различные показатели оптической плотности, то для определения концентрации гемоглобина по оптической плотности необходимо трансформировать все формы гемоглобина в одну устойчивую форму, что выполняется с помощью специальных веществ трансформирующих агентов. В качестве унифицированного в настоящее время принят цианметгемоглобиновый метод, при котором все формы гемоглобина трансформируются к гемоглобинцианиду, оптическая плотность которого измеряется в области длины волны 540 нм.

Главным недостатком цианметгемоглобинового метода является использование токсичных трансформирующих агентов (цианистый калий или ацетонциангидрин).

Поскольку при определении концентрации в крови как лейкоцитов, так и гемоглобина требуется произвести разрушение эритроцитов, сопровождающееся выходом гемоглобина в раствор, для упрощения процедуры исследования на практике используют гемолизат, полученный из одного и того же разведения крови, как для определения концентрации лейкоцитов (с использованием, например, кондуктометрических счетчиков), так и для определения концентрации гемоглобина. Однако, в этом случае к лизирующему реактиву предъявляются противоречивые требования: с одной стороны, для точного определения концентрации гемоглобина требуется произвести разрушение не только эритроцитов, но и лейкоцитов (поскольку рассеяние света на лейкоцитах может приводить к существенным погрешностям при измерении оптической плотности например, в случаях лейкоцитоза и т.д.), а для определения концентрации лейкоцитов последние должны быть сохранены. Кроме того желательно наличие у лизирующего реактива свойства трансформировать все формы гемоглобина к единому продукту, чтобы избежать использование токсичных трансформирующих агентов.

Наиболее близким к предлагаемым способу определения концентрации гемоглобина в крови и реактиву для лизирования клеток крови являются известный способ и реактив. Известный реактив включает лизирующий агент на основе полиоксиэтилена, буферный агент для поддержания определенного значения рН и воду. Известный реактив эффективно и быстро лизирует эритроциты, при этом число лейкоцитов остается неизменным. Определение концентрации гемоглобина с использованием данного лизирующего реактива не требует применения трансформирующих агентов и производится путем разбавления пробы крови в заданном соотношении, добавления к получившемуся разведению лизирующего реактива и последующего измерения оптической плотности гемолизата в области длины волны 540 нм. В отличие от цианметгемоглобинового в данном способе не используются токсичные вещества, однако при использовании указанного лизирующего реактива происходит преобразование различных форм гемоглобина к оксигемоглобину, что ограничивает точность определения концентрации гемоглобина, так как известно, что не все формы гемоглобина (например, метгемоглобин, карбоксигемоглобин и др.) могут быть трансформированы в оксигемоглобин. В результате в ряде случаев возникает существенная погрешность в определении концентрации гемоглобина (например, у курильщиков, при некоторых отравлениях и т.д.). Другим недостатком известных способа и реактива, ограничивающим точность определения концентрации гемоглобина, является то, что присутствии лейкоцитов в гемолизате при измерении оптической плотности вызывает рассеяние света, что проявляется при измерениях как увеличение оптической плотности, приводящее к завышению измеряемой концентрации гемоглобина.

Настоящее изобретение направлено на достижение следующего технического результата: повышение точности определения концентрации гемоглобина при возможности использования гемолизата, полученного из одного и того же разведения крови, для определения концентраций как лейкоцитов, так и гемоглобина.

Указанный результат достигается тем, что в способе определения концентрации гемоглобина в крови, включающем разбавление крови в заданном соотношении, добавление к полученному разведению лизирующего реактива и определение концентрации гемоглобина путем измерения оптической плотности гемолизата, согласно изобретению измерение оптической плотности проводят в области длины волны 405 нм.

В предложенном способе используется реактив для лизирования клеток крови, включающий лизирующий агент, буферный агент для поддержания значения рН и воду, при этом в качестве лизирующего агента используется четвертичная аммониевая соль, имеющая общую формулу строения

R2 ___ R3X^- где R1, R2, R3 короткие алкильные группы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода;

R4 алкильная группа, содержащая от 12 до 16 атомов углерода;

Х галоген.

Предпочтительным является использование четвертичной аммониевой соли с алкильной группой R4, содержащей от 14 до 16 атомов углерода.

Кроме того, реактив может дополнительно содержать неионное поверхностно-активное вещество (ПАВ).

Кроме того, реактив может дополнительно содержать антикоагулянт.

Кроме того, реактив может дополнительно содержать консервант.

В качестве неионного ПАВ могут быть использованы Triton X-100 или Brij-35.

В качестве антикоагулянта могут быть использованы цитрат натрия или калия.

В качестве консерванта могут быть использованы тетраборат натрия или формалин.

В качестве буферного агента может быть использован трис-гидроксиметил-аминометан.

Измерение оптической плотности в области длины волны 405 нм позволяет повысить точность определения концентрации гемоглобина за счет того, что конечный продукт реакции гемолитика с разведением крови, имеющий максимум спектра поглощения в области 405 нм, является производным от всех основных форм гемоглобина. Кроме того, в области длины волны 405 нм оптическая плотность гемолизата существенно выше, чем в области 540 нм, что позволяет уменьшить ошибку из-за рассеяния света на лейкоцитах и других рассеивающих частицах.

Использование в качестве лизирующего агента четвертичной аммониевой соли с указанной формулой строения позволяет осуществлять не только разрушение (лизис) эритроцитов, но и трансформацию всех основных форм гемоглобина к устойчивому конечному продукту (без использования трансформирующих агентов), спектр поглощения которого имеет максимум в области 405 нм. Кроме того, под действием данного лизирующего агента лизис эритроцитов протекает существенно быстрее, чем лизис лейкоцитов, что позволяет проводить точные определения концентраций лейкоцитов и гемоглобина при использовании гемолизата, полученного из одного и того же разведения крови.

Использование четвертичной аммониевой соли с алкильной группой, содержащей от 14 до 16 атомов углерода, позволяет повысить эффективность лизиса эритроцитов за счет разрушения их на более мелкие частицы. В качестве лизирующего агента могут быть использованы, например, этилгексадецилдиметиламмоний бромид, этилгексадецилдиметиламмоний хлорид, гексадецилтриметиламмоний бромид и т.д.

Введение в состав реактива неионного ПАВ способствует дальнейшему "дроблению" частиц, получающихся в результате разрушения эритроцитов.

Введение в состав реактива антикоагулянта позволяет избежать снижения точности, возникающего вследствие образования в гемолизате с течением времени сгустков, соизмеримых по объему с лейкоцитами.

Введение в состав реактива консерванта позволяет избежать бактериального загрязнения, что обеспечивает возможность длительного хранения реактива.

На фиг.1-3 представлены распределения лейкоцитов по объему, полученные в различные моменты времени после добавления к разведению крови лизирующего реактива; на фиг.4 спектр поглощения получаемого гемолизата крови; на фиг.5 корреляционная зависимость между результатами определения концентрации гемоглобина предложенным способом и референтным цианметгемоглобиновым методом.

Способ осуществляется следующим образом. Проводят разбавление пробы крови (с использованием, например, физиологического раствора или раствора Локка) в соотношении, например, 1:500. Затем добавляют к полученному разведению крови лизирующий реактив, после истечения определенного времени (длительность этого времени зависит как от количественного состава, так и от объема добавляемого гемолитика) проводят измерение оптической плотности гемолизата в области длины волны 405 нм, по результатам измерения определяют концентрацию гемоглобина (при этом имеется однозначное соответствие между измеренным значением оптической плотности и концентрацией гемоглобина, а конкретное значение коэффициента связи между ними определяют предварительно, как и в известных способах, с помощью проб крови с известными значениями концентрации гемоглобина, полученными, например, референтным методом).

В таблице представлен пример количественного состава лизирующего реактива.

Содержание каждой составляющей может отличаться от табличных значений и выбирается из следующих соображений.

Уменьшение содержания лизирующего агента приводит к замедлению лизиса эритроцитов и увеличению размеров, образующихся в результате частиц, а увеличение к ускоренному разрушению лейкоцитов.

Содержание буферного агента выбирается исходя из необходимости поддержания значения рН в пределах 9.11 для воспроизведения стабильных условий протекания реакции гемолитика с разведением крови.

Уменьшение содержания антикоагулянта приводит к ускорению слипания эритроцитарных частиц.

Уменьшение содержания неионного ПАВ приводит к увеличению размеров эритроцитарных частиц, а увеличение к ускоренному разрушению лейкоцитов.

На фиг.1-3 приведены распределения частиц по объему, полученные через 1, 15 и 30 мин после добавления данного реактива к разведению крови. Как видно из фиг. 1, уже через 1 мин после добавления гемолитика происходит полный и эффективный гемолиз эритроцитов, а в распределении лейкоцитов имеется два пика, соответствующие двум основным субпопуляциям лейкоцитов лимфоцитам и гранулоцитам. Из фиг.2 видно, что через 15 мин второй пик исчезает, что объясняется уменьшением гранулоцитов в объеме, однако общая концентрация лейкоцитов остается неизменной. Из фиг.2, 3 видно, что такое распределение частиц по объему сохраняется в течение 30 мин. Таким образом, в интервале от 1 до 30 мин может быть выполнено точное определение концентрации лейкоцитов с использованием, например, кондуктометрического счетчика.

На фиг. 4 представлен спектр поглощения получаемого гемолизата. Путем экспериментальных исследований установлено, что этот спектр, отличающийся от спектров основных форм гемоглобина, соответствует определенному устойчивому конечному продукту реакции используемого гемолитика с разведением крови, причем данный конечный продукт является производным от всех основных форм гемоглобина, т.е. все основные формы гемоглобина трансформируются к данному конечному продукту, при этом подобная трансформация гемоглобина может происходить при использовании как предложенного гемолитика, так и некоторых других. Характер получаемого спектра позволяет сделать вывод, что для определения концентрации гемоглобина по оптической плотности гемолизата следует использовать область длины волны 405 нм. Для физиологических и патологических концентраций гемоглобина оптическая плотность в области указанной длины волны существенно выше, чем в области длины волны 540 нм, поэтому измерение в области высоких значений оптической плотности позволяет существенно уменьшить ошибку, связанную с рассеянием света на лейкоцитах.

Корреляционный анализ результатов определения концентрации гемоглобина референтным цианметгемоглобиновым методом и предложенным способом показал, что коэффициент корреляции результатов составляет 0,984. Близкое к единице значение коэффициента корреляции подтверждает высокую точность предложенного способа и адекватность положенных в его основу предпосылок.