способ получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВОГЕРПЕТИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА путем спиртовой обработки плазмы невацинированных доноров с высоким содержанием антител к вирусу простого герпеса последовательно 8-, 25- и 17%-ным раствором этилового спирта с последующим центрифугированием и отделением целевого продукта, отличающийся тем, что после обработки раствором 17%-ного этилового спирта собирают осадок, разводят водой, инкубируют при перемешивании, центрифугируют, обрабатывают хлороформом и декстрансульфатом, снова центрифугируют и проводят поэтапное осаждение целевого продукта полиэтиленгликолем из расчета 2 4, 5 7, 12 14 об.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекций, вызываемых вирусом простого герпеса (ВПГ).

Актуальность изобретения обуславливается резким увеличением в настоящее время числа заболеваний, вызываемых ВПГ, что связано в значительной степени с ухудшающейся экологической обстановкой, а также с все более широким применением иммуносупрессивной терапии.

Одним из перспективных подходов при профилактике и лечении герпесвирусных инфекций является применение препаратов иммуноглобулинов человека.

К настоящему моменту установлено, что вирусспецифические антитела играют существенную роль в патогенезе герпетических инфекций. Защитное действие герпесспецифических антител связывают как с их непосредственным участием в нейтрализации вирусных частиц, так и с активацией или комплемент-опосредованного лизиса и антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности в отношении инфицированных ВПГ-клеток.

В настоящее время выпуск препарата противогерпетического иммуноглобулина человека, как в отечественной медицинской промышленности, так и за рубежом не налажен.

Известен способ получения препарата цитомегаловирусного иммуноглобулина (U.S.Pat. No. 4.617, 379). Он предусматривает отбор плазмы нативных невакцинированных доноров с высокими титрами антител к цитомегаловирусу и ее последующее фракционирование по методу Cohn и Оncley с целью получения фракции II, представляющей собой гипериммунный цитомегаловирусный иммуноглобулин.

Однако данный способ получения препарата иммуноглобулина предусматривает использование дорогостоящего сырья плазмы крови доноров. Кроме того, образующийся при фракционировании плазмы осадок Б (фракция III Кона), является балластной фракцией и не утилизируется.

Целью настоящего изобретения является удешевление способа производства препарата противогерпетического иммуноглобулина человека и утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы крови человека.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья для производства препарата противогерпетического иммуноглобулина человека используется осадок Б (фракция III Кона), образующийся при спиртовом фракционировании плазмы крови нативных невакцинированных доноров, имеющей исходно высокое содержание антител к ВПГ.

Проведенные нами исследования показали, что осадок Б содержит герпесспецифические антитела, причем их титры имеют практически те же значения, что и в плазме крови, что позволяет рассматривать осадок Б как доступное дешевое сырье для получения препарата противогерпетического иммуноглобулина человека. Преимущество использования данного источника сырья заключается также в том, что осадок Б обогащен 3 и 4 подклассами IgG. Это особенно важно, так как известно, что при рецидивирующей герпетической инфекции герпесспецифические антитела представлены в основном 1, 3 и 4 подклассами IgG.

Способ предусматривает обработку водного экстракта осадка Б хлороформом и декстрансульфатом, после чего проводится последовательное фракционирование раствором полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 из рассчета 2-4% по объему и 5-7% по объему. Для осаждения фракции IgG добавляют полиэтиленгликоль до насыщения 12-14% по объему.

Способ поясняют следующим примером.

Приготовление экстракта из осадка Б.

1 кг осадка Б суспендируют в 30 л охлажденной апирогенной дистиллированной воды при постоянном перемешивании. рН смеси устанавливают 5,2-0,5. После отстаивания в течение 18 ч при t + 5^oC смесь центрифугируют в течение 1 ч при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Осадок удаляют, в полученном экстракте определяют содержание белка, которое равно 1% Объем полученного экстракта составляет 15900 мл.

Удаление балластных фракций путем обработки экстракта осадка Б хлороформом и декстрансульфатом.

К экстракту осадка Б добавляют 160 мл охлажденного до +5^оС хлороформа (1% по объему). Смесь медленно перемешивают в течение 2 ч при температуре +5^оС. К смеси экстракта с хлороформом добавляют 328 мл 5%-ного раствора декстрансульфата (конечная концентрация 0,1%). Смесь энергично встряхивают в течение 5-10 мин и центрифугируют при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением до получения прозрачного центрифугата. Осадок удаляют. Объем центрифугата составляет 12 л, содержание белка 0,2%

Осаждение IgG полиэтиленгликолем (ПЭГ).

К 12 л экстракта добавляют ПЭГ (М.В.4000) из рассчета 2 г на 100 мл раствора при постоянном перемешивании. Через 2 ч осадок отделяют фильтрацией через миллипоровые фильтры = 0,45, а к супернатанту добавляют ПЭГ из расчета 6% по объему. Смесь медленно перемешивают в течение 2 ч. Образовавшийся осадок удаляют путем фильтрации через миллипоровые фильтры = 0,45. рН супернатанта доводят до 8,0 6% тригидроксиэтиламинометаном.

Для осаждения IgG к супернатанту добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 13% при постоянном перемешивании.

Осадок IgG отделяют путем декантации и центрифугирования в течение 15-30 мин при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Осадок промывают 300-400 мл апирогенной дистиллированной воды, подкисленной до рН 50,2 при температуре от 0 до +2.

Растворение осадка IgG.

Осадок IgG растворяют в охлажденном 0,9%-ном растворе хлорида натрия до содержания белка 10% рН 6,3. После растворения осадка препарат центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин на центрифуге с охлаждением для удаления нерастворимых примесей.

К раствору после центрифугирования добавляют глюкозу до конечной концентрации 2% в качестве стабилизатора. После стерилизующей фильтрации через миллипоровые фильтры = 0,2 препарат разливают по ампулам и лиофилизируют. Хранят в сухом темном месте при температуре (64)^оС. Срок хранения 3 года.

После растворения осадка IgG в готовом препарате определяют количественное содержание подклассов IgG и специфическую активность.

Распределение подклассов IgG определенное методом радиальной иммунодиффузии с использованием стандартов фирмы Nordic Immunological Laboratories", представлено в таблице.

Титр антител в препарате, определенный методом твердофазного иммуноферментного анализа, составляет 1: 256000, что позволяет использовать данный препарат в профилактических и лечебных целях при инфекциях, вызываемых ВПГ.

Количество иммунологически неактивных примесей составляет не более 2-3% что регламентировано НТД на иммуноглобулин.

Предлагаемый способ имеет преимущество, так как позволяет получить из балластной фракции III (осадок Б) препарат противогерпетического иммуноглобулина человека, состоящий на 97% из IgG.

Технико-экономическая эффективность.

Предлагаемый способ позволяет удешевить производство препарата противогерпетического иммуноглобулина человека и использовать отходы промышленного фракционирования плазмы крови человека, так как он предполагает использование в качестве исходного сырья при производстве препарата осадка Б, являющегося балластной фракцией, образующейся при спиртовом фракционировании плазмы крови.