способ отбора лекарственных препаратов, обладающих противораковой активностью

Формула изобретения

СПОСОБ ОТБОРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОРАКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, включающий воздействие на биологический объект с вызванной онкологией препаратом с последующим исследованием его биологического действия и оценкой коррегирующего эффекта по результатам терапии животных опухоленосителей и отбора эффективных препаратов, отличающийся тем, что исследуют зависимость выживаемости обновляющейся ткани и/или экспериментального животного от периода многократных периодических применений препарата, затем осуществляют первичный отбор препарата при выявлении резонансного типа указанных зависимостей, а терапевтическую эффективность препарата оценивают при его использовании в режимах, включающих периодические применения препарата с периодом, соответствующим максимуму резонансной зависимости.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и медицинской технике, в частности в экспериментальной медицине.

Наиболее сложным в решении задачи по отбору того или иного лекарственного препарата является выбор модели, с помощью которой она будет выполняться. Это тем более касается проблемы, связанной с вопросами онкологии. Многочисленные разработки ее (использование культур клеток, тканей, линий животных и т.д.) достаточно информативные сами по себе, имеют один и тот же недостаток невозможность одновременно со скринингом лекарственного препарата (имеется ввиду отбор препарата из ряда других в группу перспективных) адекватно оценить его терапевтическую эффективность прежде всего из-за отсутствия схем испытаний, учитывающих особенности цитотоксического действия различных препаратов.

Известно, что эффективность противоопухолевых препаратов чаще всего ограничена их токсическим действием на нормальные клетки, в первую очередь на клетки кроветворной ткани и эпителия кишечника. В этой связи особые надежды связываются с оптимизацией режима введения противоопухолевых препаратов, особенно цикло- и фазоспецифичных цитотоксических агентов. Предполагается, что используя различия в регуляции пролиферации и кинетике популяций опухолевых клеток и стволовых клеток нормальной ткани, можно подобрать режимы введения препаратов, ведущие к селективному поражению опухолевых клеток.

Предложена новая модель скрининга лекарственных препаратов противоракового назначения, которая заключается в следующем: на первом этапе на экспериментальных животных отбираются препараты, обеспечивающие резонансный тип зависимости выживаемости активно делящихся клеток организма от периода многократных периодических введений препарата (таким свойством обладают препараты, проявляющие фазоспецифический цитотоксический эффект при их введении в организм). Отбор соответствующих препаратов может осуществляться как на основе анализа поражения различных обновляющихся тканей, в том числе опухолевых, так и исходя из анализа выживаемости экспериментальных животных.

На втором этапе определяется обновляющаяся нормальная ткань, лимитирующая применение данного препарата (критическая нормальная ткань), т.е. ткань, поражение которой под действием исследуемого препарата ведет в конечном итоге к гибели животного.

На третьем этапе выбирается период (т.е. интервал между введениями препарата), обеспечивающий главный резонансный максимум выживаемости критической нормальной ткани.

Четвертый этап заключается в оценке терапевтической эффективности отобранного препарата. Оценка терапевтической эффективности препарата производится при его использовании в режимах, включающих многократные периодические введения препарата с периодом, соответствующим главному резонансному максимуму выживаемости критической нормальной ткани, и приводящих к LD 10 для интактных животных. В экспериментах используются животные-опухоленосители с опухолями, у которых средняя длительность клеточного цикла активно делящихся клеток заметно превосходит среднюю длительность клеточного цикла активно делящихся клеток критической нормальной ткани. Для оценки перспективности препарата используются общепринятые критерии: увеличение продолжительности жизни животных опухоленосителей и/или процент выживаемости животных, и/или подавление роста опухоли.

Известен способ отбора лекарственных препаратов, обладающих противораковой активностью, который заключается в следующем. Используются следующие режимы: а) однократное введение препарата; б) ежедневные введения препарата; в) введения препарата с интервалами 96 ч. Для данных курсов подбираются дозы препаратов, обеспечивающие LD 10 для экспериментальных животных. Указанные курсы с выбранными дозами препарата используются для терапии животных опухоленосителей. Терапевтический эффект, т.е. фактически эффективность препарата, оценивается по увеличению продолжительности жизни животных опухоленосителей и/или проценту вылеченных животных, и/или подавлению роста опухоли.

Преимущества предлагаемого способа повышение точности способа за счет более адекватного отбора перспективных для лечения онкологии препаратов, отбора препаратов, обладающих избирательным цитотоксическим эффектом относительно раковых клеток; новая модель тестирования цитотоксических веществ; повышение эффективности отбора за счет исключения возможности ошибочного суждения о неэффективности препарата, связанной в действительности с неправильным режимом его применения в процессе тестирования.

На фиг.1 приведена зависимость выживаемости КОЕс мышей (СВАхС56ВL)F1 от периода 6-кратных введений ОМ (разовая доза 1 г/кг). По оси абсцисс период введения ОМ (ч), по оси ординат количество выживших КОЕс (% от исходного уровня). Разные символы соответствуют независимым экспериментам, указаны доверительные интервалы с уровнями значимости р<0,3. Сплошная линия соответствует расчетной зависимости. На фиг.2 зависимость поражения эпителия тонкой кишки мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода 8-кратных введений ОМ (по 0,25 г/кг). По оси абсцисс период введения ОМ (ч); по оси ординат: а количество крипт на срез кишки; б общее количество энтероцитов крипт на срез кишки (х10^-3); в число клеточных позиций на ворсинках. Указаны Мm(m ошибка средней) через 30 ч после окончания введений ОМ. Заштрихованы диапазоны М+м для контрольных животных. Для контрольных животных число клеточных позиций на ворсинках равно 1086. Расчетные кривые обозначены сплошными линиями. На фиг.3 зависимость выживаемости мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода введения ОМ (разовая доза 0,25 г/кг). По оси абсцисс период введения ОМ; по оси ординат количество выживших мышей (% от исходного); -8 инъекций; - 6 инъекций.

П р и м е р 1. Резонансный эффект для ранних гемопоэтических предшественников. В эксперименте исследовали зависимость выживаемости КОЕс мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода 6-кратных инъекций высоких доз (1 г/кг) оксимочевины (ОМ). Результаты двух независимых серий экспериментов и расчетная зависимость приведены на фиг.1.

Согласно полученным результатам имеет место четко выраженный резонансный эффект с резонансным максимумом выживаемости КОЕс при введении ОМ с периодом 12 ч. Ранее попытки оценки параметров цикла этих неидентифицируемых прямо клеток неоднократно предпринимались, но не привели к желаемым результатам.

П р и м е р 2. Резонансный эффект для эпителия тонкой кишки. В эксперименте исследовали зависимость поражения эпителия тонкой кишки мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода 8-кратных введений ОМ (по 0,25 г/кг).

Состояние эпителия оценивали по морфометрическим показателям на фиксированных формалином срезах тонкой кишки. Контролировалось поражение различных клеточных компартментов эпителия, соответствующих клеткам разных стадий дифференцировки (от стволовых до функционально зрелых). Для всех клеточных компартментов выявлены четкие резонансные зависимости выживаемости клеток от периода введения ОМ с максимумом выживаемости клеток, соответствующими введениями ОМ с периодами, близкими к 8 или 16 ч.

Таким образом, резонансный эффект проявлялся не только для отдельных клеточных популяций, но и на уровне всей обновляющейся ткани. Положение резонансных максимумов не зависит от начального состояния эпителия (интактный или регенерирующий после облучения) и количества инъекций.

Результаты одной серии экспериментов и соответствующие расчетные зависимости приведены на фиг.2.

Данные по количеству выживших крипт отражают выживаемость стволовых (криптогенных) клеток, общее число энтероцитов крипт соответствует численности пролиферирующих эпителиальных клеток, число клеточных позиций на ворсинках общепринятым показателем численности непролиферирующих, функционально зрелых энтероцитов.

Для более полного понимания зависимости поражения эпителия от периода введения ОМ морфометрические данные дополнены электронно-микроскопическим исследованием ультраструктуры энтероцитов ворсинок. Согласно полученным данным, эта зависимость в действительности является еще более контрастной, чем об этом можно судить по морфометрическим показателям, отраженным на фиг.2.

П р и м е р 3. Зависимость выживаемости мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода введения оксимочевины. В данной серии экспериментов исследовали зависимость выживания мышей (СВАхС57ВL)F1 от периода инъекций ОМ разовая доза 0,25 г/кг.

Полученные результаты подтверждают корректность перехода от выживаемости организма к поражению одной ткани и наоборот.

Согласно приведенным результатам, выживаемость мышей резонансным образом зависит от периода воздействия препаратом и при варьировании периода изменяется синфазно с выживаемостью эпителия тонкой кишки и криптогенных клеток этой ткани.

Аналогичные резонансные зависимости для выживания мышей получены и в случае широко используемого в противоопухолевой терапии S-фазоспецифического агента цитозин-арабинозида.

Приведенные материалы свидетельствуют о целесообразности использования в практике скрининга противораковых препаратов предложенной модели и алгоритма оценки эффективности препарата, описанного в изобретении.