способ синтеза метилового эфира n-бензилоксикарбонил-l- аспартил-l-фенилаланина

Формула изобретения

СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА N-БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА путем проведения реакции конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L- или D, L-фенилаланина в присутствии металлопротеиназы микробного происхождения, отличающийся тем, что N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D, L-фенилаланина вводят в реакцию конденсации непосредственно в составе реакционных смесей, полученных соответственно при обработке L-аспарагиновой кислоты бензилоксикарбонил-хлоридом в щелочной среде с содержанием до 5% незамещенной L-аспарагиновой кислоты и при этерификации L- или D, L-фенилаланина метиловым спиртом с содержанием до 5% свободного L- или D, L-фенилаланина, а конденсацию проводят в присутствии металлопротеиназы Bacillus megaterium.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к пептидной химии, в частности к способу синтеза метилового эфира N-бензилоксикар- бонил-L-аспартил-L-фенилаланина предшественника дипептида аспартама.

Аспартам является интенсивным подсластителем. Его используют в медицине: для питания больных, страдающих диабетом и ожирением; в пищевой промышленности: для изготовления соков, джемов, мороженого, при производстве молочных изделий; в фармацевтической промышленности: в облатках лекарств; в парфюмерной промышленности: для изготовления кремов, губной помады, зубных эликсиров и т.д.

Существуют многочисленные способы синтеза аспартама (1), некоторые из них нашли применение в промышленном производстве этого подсластителя. Среди химических способов получения предшественника аспартама наибольшее развитие получил ангидридный метод.

Наиболее перспективен ферментативный синтез предшественника аспартама, свободный от многих недостатков, присущих химическому методу, в особенности, в области стерео- и региоспецифичности синтеза. Такой способ, разработанный группой японских авторов (2), является ближайшим аналогом.

Синтез предшественника аспартама по данному способу осуществляют с использованием бензилоксикарбонильной группы в качестве защитной группировки для аминной функции L-аспарагиновой кислоты. Непосредственно синтез предшественника происходит в результате реакции конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты с метиловым эфиром L- или D,L-фенилаланина. Сдвиг равновесия синтеза достигают тем, что образующийся в результате реакции аддукт дипептида (метилового эфира N-бензилоксикарбонил-аспартил-фенилаланина) и метилового эфира L- или D,L-фенилаланина выпадает в осадок. Реакцию проводят при молярном соотношении карбоксильного и аминокомпонентов от 1:1 до 1:3,75 в диапазоне рН 5,0-7,2 и температуре 10-90^оС. Катализатором синтеза предшественника служат металлопротеиназы различных микроорганизмов, в частности термолизин. Максимальный выход конечного продукта в расчете на N-бензил- оксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту составляет в случае использования L-фенил- аланина 95,5% а в случае использования D,L-фенилаланина 90,9%

Необходимо отметить, что для синтеза предшественника аспартама используют очищенные препараты метилового эфира L- или D,L-фенилаланина и N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты. Известно, что получение этих промежуточных веществ сопряжено с рядом трудностей, касающихся не только синтеза, но и выделения их в чистом виде из реакционных смесей.

Целью изобретения является упрощение и удешевление процедуры синтеза предшественника аспартама метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина.

Цель достигают тем, что промежуточные продукты синтеза предшественника: N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D,L-фенилаланина вводят в реакцию конденсации непосредственно в составе реакционных смесей, полученных соответственно при обработке L-аспарагиновой кислоты бензилоксикарбонил-хлоридом в щелочной среде с содержанием до 5% незамещенной L-аспарагиновой кислоты и при этерификации L- или D,L-фенилаланина метиловым спиртом с содержанием до 5% свободного L- или D,L-фенилаланина.

Способ в общем виде. Ферментативный синтез метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина осуществляют как в ближайшем аналоге, но промежуточные вещества: N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D,L-фенилаланина вводят в реакцию конденсации в составе реакционных смесей, полученных соответственно при обработке L-аспарагиновой кислоты бензилоксикарбонил-хлоридом в щелочной среде и при этерификации L- или D,L-фенилаланина метиловым спиртом. В качестве катализатора реакции образования пептидной связи используют металлопротеиназу, секретируемую продуцентом Bacillus megaterium, например, шт.В-5818 (3), имеющую удельную активность 5 ед./о.е. по субстрату Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg-OH. Выход синтеза метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту составляет в случае использования L-фенилаланина до 96% а в случае использования D,L-фенилаланина до 94%

П р и м е р 1. Синтез метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенил- аланина с использованием D,L-фенилаланина. Стадия 1. Получение N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты.

50 г (376 ммоль) L-аспарагиновой кислоты суспендируют при перемешивании на магнитной мешалке в 200 мл дист. воды (рН суспензии 2,3). Из капельной воронки добавляют 50%-ный раствор NaOH до рН 10,5-11 (расход раствора NaOH 55 мл). При этом происходит растворение L-аспарагиновой кислоты. К этому раствору при комнатной температуре (18-25^оС) и при поддержании значения рН на том же уровне в течение трех часов при постоянном перемешивании из капельной воронки прибавляют 61 мл (406 ммоль) бензилокси- карбонилхлорида. После окончания прибавления всего количества бензилоксикарбонилхлорида реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при 18-25^оС, а затем в течение еще 6 ч при 46-48^оС, поддерживая значение рН на том же уровне. Затем реакционную смесь фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр. Выход синтеза N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты, рассчитанный по данным аминокислотного анализа и офВЭЖХ, составляет 95% Содержание незамещенной L-аспарагиновой кислоты составляет 5% от исходного. Стадия 2. Получение хлоргидрата метилового эфира D,L-фенилаланина.

21,4 мл метанола и 8,12 г (48,8 ммоль) D,L-фенилаланина загружают в колбу, помещают в ледяную баню и охлаждают при перемешивании в течение 25-35 мин до 7^оС. Затем при той же температуре из капельной воронки прибавляют порциями в течение 0,5-1 ч 3,48 мл (48,96 ммоль) хлористого тионила. После прибавления всего количества хлористого тионила колбу извлекают из ледяной бани и нагревают реакционную смесь при перемешивании в течение 1,5-2 ч до температуры кипения (около 64^оС), присоединив обратный холодильник, после чего ведут кипячение реакционной смеси в течение 6 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и упаривают под вакуумом. Выход хлоргидрата метилового эфира D, L-фенилаланина, рассчитанный по данным аминокислотного анализа, составляет 95% Содержание свободного D,L-фенилаланина составляет 5% от исходного.

Стадия 3. Синтез метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенил-аланина.

К полученному на стадии 2 продукту, содержащему 9,97 г (46,4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира D,L-фенилаланина, добавляют 101 мл дист.воды, а затем при перемешивании небольшими порциями прибавляют аликвоту реакционной смеси со стадии 1 (15,3 мл), которая содержит 21,1 ммоль N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты. Для поддержания рН смеси в диапазоне 6,0-6,2 добавляют при необходимости 10%-ный раствор едкого натра (не более 2 мл), затем медленно всыпают 544 мг препарата фермента металлопротеиназы B.megaterium. Синтез ведут при температуре бани 26-28^оС в течение 22-24 ч. Выход конечного продукта 94% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

П р и м е р 2. Синтез метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фе- нилаланина с использованием L-фенилаланина.

То же, что в примере 1, но на стадии 2 из L-фенилаланина получают хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина, который затем используют в реакции получения конечного продукта. Выход метилового эфира L-фенилаланина на стадии 2 составляет 95% при содержании свободного L-фенилаланина 5% от исходного. Выход синтеза метилового эфира N-бензилоксикар- бонил-L-аспартил-L-фенилаланина в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту составляет 96%

Таким образом, способ позволяет упростить и удешевить процесс синтеза за счет использования реакционных смесей вместо высокоочищенных исходных реагентов, допуская наличие в реакционной смеси до 5% исходных свободных аминокислот. При этом удается избежать добавления в сферу реакции дополнительных реагентов, например, соляной кислоты, которая требуется для подкисления щелочного раствора N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты в случае выделения ее в виде кристаллического продукта. При использовании промежуточных продуктов в виде реакционных смесей подкисление происходит за счет содержащегося в реакционной смеси хлоргидрата метилового эфира L- или D,L-фенилаланина.