способ получения 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой
Классы МПК:
A61K38/17 из животных; из человека A61K38/39 пептиды соединительной ткани, например коллаген, эластин, ламинин, фибронектин, витронектин, холодный нерастворимый глобулин (CIG)
Автор(ы):
Кубанова Анна Алексеевна, Матушевская Елена Владиславовна, Скрипкин Юрий Константинович, Чехонин Владимир Павлович
Патентообладатель(и):
Кубанова Анна Алексеевна, Матушевская Елена Владиславовна, Скрипкин Юрий Константинович, Чехонин Владимир Павлович
Приоритеты:
подача заявки: 1993-12-30
публикация патента: 10.09.1995
Изобретение относится к медицине, в частности дерматологии, а именно к способу получения 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 глубулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ получения 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, включающий осаждение белков пузырной жидкости сульфатом аммония с последующим растворением его в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4, далее препарат очищают методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте от 0,2 до 0,6 М NaCl, методом гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе 4В, отбирая фракцию в градиенте 0,6 0 М (NH4)2SO4, после диализа подвергают гель - фильтрации на сефадексе G-200, собирая фракцию с мол. м. 50 70 кД и афинной хроматографии на Кон-А-агарозе, при этом целевой продукт представляет собой фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -D-гликопиранозида от 2,5 до 3,0% имеет мол. м. 60 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10 кД, относительную электрофоретическую подвижность 0,83 + 0,02 и изоэлектрическую точку pI 5,25 + 0,23. На основе препарата, полученного заявляемым способом, предполагается разработать способ получения высококачественного препарата антител к нему. Антитела к 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 -глобулину пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, предполагается использовать в качестве диагностикума истинной пузырчатки, а также для мониторинга и оценки качества проводимой терапии. 2 табл.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 -ГЛОБУЛИНА ПУЗЫРНОЙ ЖИДКОСТИ, АССОЦИИРОВАННОГО С ИСТИННОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ, включающий осаждение белков пузырной жидкости сульфатом аммония с последующим растворением его в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,4, далее препарат очищают методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, при этом отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте от 0,2 до 0,6 М NaCl, методом гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе 4В, отбирая фракцию в градиенте 0,6-0 М (NH4)2SO4, после диализа подвергают гель-фильтрации на сефадексе G 200, собирая фракцию с мол.м. 50-70 КД и афинной хроматографии на Кон. -а агарозе, при этом целевой продукт представляет собой фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> - D гликопиранозида от 2,5 до 3,0% имеет мол.м. 60 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10 кД, относительную электрофоретическую подвижность 0,83 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,02 и изоэлектрическую точку pJ 5,25 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,23.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, а именно к способу получения 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой. Рост заболеваемости пузырными дерматозами в мире, невыясненность механизмов отмены толерантности к мембранным антигенам шиповатых эпителиоцитов, возникновение акантолиза и эпидермо-дермального разъединения патологических процессов послужило основой для начала серии новых исследований по изучению возможностей маркирования патологических процессов при истинной пузырчатке. В данной работе проведен анализ спектра белков пузырной жидкости больных пузырчаткой и изучение физико-химических свойств гликопротеида, ассоциированного с пузырчаткой. Известны различные способы получения белков с электрофоретической подвижностью 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулинов из биологических материалов, например из атеросклеротически измененной стенки аорты. Способ получения этого 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-гликопротеида представлен на следующей схеме: Ткани аорты измельчали на гомогенизаторе при 10000g и делипидировали смесью хлороформа и метанола (V1:V2=3:1). Остаток лиофильно высушивали 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> ионообменная хроматография на ДЕАЕ-52 целлюлозе Элюция 0,5 М Nа-фосфатным буфером рН 7,0 в диапазоне концентрации NaCl от 0,12-0,2 М 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-2t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> гельфильтрация на сефадексе G-150 Элюция белковой фракции с М 802 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10 КД 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-3t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Афинная хроматография на лентил-лектин 413-сефарозе Элюция 2,5%-ным раствором 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -метилдеглюкопиранозида 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-4t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Препарат 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 -гликопротеида аортальной стенки 91%-ной чистоты Данный способ можно считать лишь одним из многочисленных аналогов заявленного метода. Прототип в доступной литературе не обнаружен, поскольку гликопротеид с электрофоретической подвижностью 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулина из пузырной жидкости получен впервые, хотя имеется некоторый опыт исследования белкового спектра пузырной жидкости. Способ осуществляют следующим образом. В работе использовали пузырную жидкость, полученную от нескольких больных истинной пузырчаткой. Пузырную жидкость в количестве 25 мл обрабатывают сульфатом аммония, взятым в 50% -ном насыщении, полученный осадок отделяют центрифугированием при 20000g, растворяют в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера при рН 7,4, добавляют 5 мл охлажденного ацетона. Далее осадок отделяют центрифугированием при 20000g, растворяют в 1 мл буферного раствора и концентрируют. Концентрированный препарат подвергают очистке по следующей схеме: ионообменная хроматография (ДЕАЕ 52 целлюлоза Watman Еngland) Отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте NаCl от 0,2 до 0,6 М 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-5t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Гидрофобная хроматография (Рhenyl сефароза 4В Рharmacia-LКВ) Отбирают фракцию, элюирующуюся в градиенте сульфата аммония от 0,6 до 0 (после этого препарат диализуют и концентрируют до 1 мл) 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-6t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Гель-фильтрация (сефадекс G-200, Рharmacia-LКВ) Отбирают фракцию мол.м. 50-70 КД 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043117/2043117-7t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> Афинная хроматография (Соп-А агароза Sigma USА) Отбирают фракцию, элюирующуюся в диапазоне концентрации 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -Д-гликопиранозида от 2,5 до 3,0% При этом, ионообменную хроматографию проводят на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (Watman, Англия), уравновешенной 0,05 М Nа-фосфатным буфером рН 7,6 (рабочий буфер) при скорости протока 40 мл/ч, гидрофобную хроматографию проводят в колонке заполненной фенил-сефарозой 4В (LКВ, Швеция), и уравновешенной рабочим буфером, содержащим 1 М сульфата аммония, при скорости протока 40 мл/ч, гель-фильтрацию осуществляют в колонке, заполненной сефадексом G-200 (Рharmacia, Швеция), уравновешенной рабочим буфером при скорости протока 5 мл/ч (для определения молекулярной массы гель-фильтрационным методом использовали стандарты фирмы Serva, Германия). Афинную хроматографию проводят на Коп-А сефарозе 4В (Рharmacia, Швеция), уравновешенной Nа-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим МgСl, СаСl, МnCl в концентрации 1 мМ, при скорости протока 1 мл/ч. Регистрацию выхода белковых фракций при хроматографиях осуществляют при помощи проточного фотометра "Uvicord S" (LКВ, Швеция), с последующей иммунохимической верификацией. Исследование аминокислотного состава проводили после гидролиза препарата 6 н. НСl в течение 12, 24 и 36 ч при 105 С на аминокислотном анализаторе "Durrum" DS-500 (USА). Полученный очищенный препарат был использован при иммунизации кроликов породы шиншилла, с целью получения моноспецифической антисыворотки. При анализе моноспецифической антисыворотки методом дискэлектрофореза с последующим иммунопроявлением, показано, что антисыворотка выявляет в пузырной жидкости один антиген с электрофоретической подвижностью 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулинов. Физико-химические свойства и аминокислотный состав полученного белка представлены в табл.1 и 2. Как видно из табл.1 исследуемый белок имеет относительную мол.м. 742 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043022/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">3,6 КД, изоэлектрическую точку 4, 6 и электрофоретическую подвижность 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулинов. В структуре белковой части преобладают пролин, глютаминовая кислота, метионин. Высокое средство с конковалином А позволяет с большей долей вероятности предполагать наличие в молекуле углеводного компонента. Очищенный 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулин вместе с моноспецифической антисывороткой к нему был оттитрован с целью конструирования стандартной тест-системы. Иммунохимический анализ 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулина в различных биологических жидкостях человека показал, что он является относительно специфичным для пузырной жидкости, полученной от больных истинной пузырчаткой, не определяется при этом в сыворотке крови и спиномозговой жидкости доноров. На основе препарата, полученного предлагаемым способом, возможно разработать способ получения высококачественного препарата антител к нему. Антитела к 2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, патент № 2043117" SRC="/images/patents/429/2043002/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2-глобулину пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой, предполагается использовать в качестве диагностикума истинной пузырчатки, а также для мониторинга и оценки качества проводимой терапии.
2 -глобулина пузырной жидкости, ассоциированного с истинной пузырчаткой
