композиция, обладающая свойством репарировать мембраны гепатоцитов

Формула изобретения

КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ РЕПАРИРОВАТЬ МЕМБРАНЫ ГЕПАТОЦИТОВ, содержащая в физиологически приемлемых концентрациях фосфолипиды и детергент, отличающаяся тем, что композиция в качестве фосфолипидов содержит обогащенную фракцию фосфолипидов подсолнечника, а в качестве детергента тринатриевую соль глицирризиновой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биохимии и фармакологии. Предлагаемая фосфолипидная композиция обладает свойством восстанавливать структуру и функцию поврежденных мембран гепатоцитов и может быть впоследствии использована для лечения заболеваний печени.

При заболеваниях печени вне зависимости от их этиологии происходит повреждение мембран гепатоцитов с потерей их основных структурных компонентов фосфолипидов и инактивацией ферментных систем, участвующих в биосинтетических и детоксикационных процессах. Экспериментально показано, что структура и функция поврежденных мембран клеток печени может быть восстановлена путем введения фосфолипидов в составе лекарственного средства.

Наиболее распространенными и применяемыми в клинической практике препаратами для лечения заболеваний печени таких, как гепатит и цирроз, являются глицирам, ликвиритон, флакарбин (Машковский М.Д. Москва, "Медицина", т.1, с. 302, 361, 362, 1988).

Эссенциале (форте) (Машковский М.Д. т.2, 1988), выбранный нами в качестве прототипа, представляет собой смесь фосфатидилхолина и солей желчных кислот. Как известно, производные желчных кислот, в частности, дезоксихолат, являются сильными детергентами и оказывают побочные токсические эффекты.

Техническим результатом данного изобретения является создание композиции, обладающей способностью репарировать мембраны гепатоцитов, но не оказывающей побочного токсического воздействия. Присутствующая в предлагаемой композиции в качестве эмульгатора тринатриевая соль глицирризиновой кислоты помимо мягкого детергентного и гепатопротекторного действия обладает противовоспалительным, противоаллергическим, противовирусным эффектом (Ехреrientia, v. 36, р.304, 1980; Sсand. Gastrienterol. v.17, р.412, 1982; S.Nagoya City Univ. Меd. Аssoc. v.30, р.333-356, 1979).

Другим техническим результатом является расширение форм препарата. Полученная таблетированная форма позволяет избегать инъекций и избавляет больных от посторонней помощи при введении лекарств. Для больных хроническими формами заболевания становится доступным амбулаторное лечение. Этот результат достигается благодаря использованию в качестве источника фосфолипидов семян подсолнечника.

Авторами был проведен сравнительный анализ различных исходных материалов продуктов переработки семян подсолнечника и был сделан вывод, что дробленые ядра семян подсолнечника позволяют выделить фракцию фосфолипидов, пригодную для получения таблетированной формы препарата.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Способ получения обогащенной фракции фосфолипидов из продуктов переработки семян подсолнечника.

1. Исходный материал (дробленые ядра семян подсолнечника) в количестве 10 г экстрагируется 30 мл этанола в течение 15 мин.

2. Твердую массу отжимают через два слоя марли. Экстракт фильтруется (широкопористая фильтровальная бумага). Твердый остаток промывается на воронке этанолом 3 раза по 30 мл.

3. Спиртовой экстракт упаривается на роторном испарителе до объема 10 мл, добавляется 50 мл ледяного ацетона и оставляется на 2 ч при 4^оС.

4. Осадок отделяется центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К-24 (ротор 6х30 мл) и высушивается в вакууме.

Характеристика обогащенной фракции фосфолипидов из продуктов переработки семян подсолнечника.

Продукт представляет собой светло-желтый порошок со следующими характеристиками:

Фракция, нераст-

воримая в холодном ацетоне не менее 98%

Содержание нейт- ральных липидов не более 2%

Растворимость в толуоле 100%

Индекс окислен- ности 0,28

Выход продукта не менее 200 мг из 10 г исходного сырья.

Чистоту выделенной фракции фосфолипидов контролировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с "Силуфол" в системе метанол-хлороформ-вода (25:65:4), проявление хроматограмм 10% фосфорномолибденовой кислотой в этиловом спирте. Содержание фосфатидилхолина 70%

Как видно из представленных данных табл.1 имеется значительное отличие в содержании 16:0 жирной кислоты, входящей в фосфолипидные фракции, получаемые из подсолнечника и сои. Именно эти различия, очевидно, влияют на физико-химические свойства фосфатидилхолина из семян подсолнечника, который получают в виде порошка бледно-желтого цвета, в то время как соевый фосфатидилхолин имеет консистенцию застывшего масла.

Способ получения фосфолипидной композиции.

Заявленную композицию получают путем смешивания фосфолипидов из семян подсолнечника и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты (производство формы Rhone-Роulenc Rorer), взятых в порошкообразном состоянии; затем полученную смесь подвергают таблетированию.

Композиция имеет следующий количественный состав: в расчете на одну таблетку фосфолипиды из семян подсолнечника 250 мг, глицирризиновая кислота 100 мг.

Биологическую активность заявляемой композиции исследовали на модельной системе in vitro и в экспериментах in vivo.

1) Исследование влияния фосфолипидных препаратов на инактивацию изолированного очищенного цитохрома Р450 микросом печени кроликов.

Цитохром Р450 является ключевым ферментом микросомальной монооксигеназной системы печени, участвующей в окислении многих чужеродных соединений и таким образом выполняющей детоксицирующую функцию. Данный гемопротеин является мембранным ферментом и обладает способностью быстро инактивироваться при различных воздействиях на мембраны. Стабилизировать данный гемопротеин в активной форме возможно путем добавления к нему фосфолипидов. В связи с этим мы использовали регистрацию инактивации изолированного очищенного цитохрома Р450 в присутствии и отсутствии фосфолипидных препаратов в качестве модельной системы для выделения их стабилизирующего эффекта.

В основе метода регистрации инактивации цитохрома Р450 лежит переход цитохрома Р450 в цитохром Р420, являющейся неактивной формой цитохрома Р450. Снижение содержания цитохрома Р450, являющееся показателем процесса инактивации цитохрома Р450, определяли по разности оптического поглощения при длинах 450 и 490 нм, и увеличение содержания цитохрома Р420 при 420 и 490 нм (Биохимия, вып. 46, с. 280-286, 1981). Влияние фосфолипидных препаратов на инактивацию цитохрома Р450 исследовали после преинкубации гемопротеина с фосфолипидными препаратами (соотношение цитохрома и фосфолипида составляло 1 нмоль и 1 мг, соответственно) в течение 15 мин при 4^оС. Затем объем смеси доводили до 6 мл 100 мМ трис-НСl буфером, рН 7,4, и разливали ее в спектрофотометрические кюветы по 3 мл. В кювету измерения пропускали в течение 1 мин СО, добавляли затем в обе кюветы несколько кристалликов дитионита натрия и регистрировали дифференциальные спектры цитохрома Р450 в диапазоне длин волн 400-500 нм в течение 20 мин при 30^оС. Расчет инактивации цитохрома Р450 проводили по методу, приведенному в ж. "Биохимия", вып.46, с.280-286. Данные по измерению инактивации гемопротеина приведены в табл.2. Показано, что время полуинактивации цитохрома Р450 в отсутствии препаратов составляет 3,4 мин, добавление к белку исследуемого препарата приводило к замедлению инактивации гемопротеина и время полуинактивации (5 мин) увеличивалось. В то же время инкубация цитохрома с Эссенциале приводило к ускорению инактивации цитохрома и время полуинактивации снижалось до 1,7 мин. Ускорение инактивации белка в присутствии Эссенциале объясняется наличием в этом препарате производных желчных кислот, в частности дезоксихолата, который является сильным детергентом и может инактивировать мембранные белки в системах in vitro. В системах in vivo дестабилизирующий эффект Эссенциале на белки нивелируется путем резкого разведения дезоксихолата в организме. Таким образом предлагаемая композиция обладает способностью стабилизировать цитохром Р450 и замедлять его инактивацию in vitro.

2) Изучение влияния фосфолипидных препаратов на инактивацию цитохрома Р450 микросом печени крыс с токсическими гепатитами после введения животным фосфолипидных препаратов.

Модель острого токсического гепатита получали одноразовым введением внутрибрюшинно гепатотоксина, четыреххлористый углерод, в дозе 0,2 мл на 100 г массы крысам-самцам. Эффект действия фосфолипидных препаратов при гепатите оценивали после внутрибрюшинного введения препаратов в течение 3 дней в дозе 20 мг на 100 г массы тела. Затем животных забивали и выделяли из печени микросомальную фракцию стандартным методом, как описано в ж. "Биохимия", вып.44, с.1049-1057, 1979.

Для регистрации инактивации цитохрома Р450 суспензию микросом, полученных из трех групп животных (1 группа токсический гепатит; 2 группа токсический гепатит с последующим введением исследуемого препарата; 3 группа токсический гепатит с последующим введением Эссенциале) с содержанием 6 нмолей гемопротеина разводили в 6 мл 100 мМ трис-НСl буфера, рН 7,4, и регистрировали дифференциальные спектры в течение 20 мин при 37^оС. Время полуинактивации рассчитывали, как описано выше. Как видно из данных табл.3 при токсическом гепатите время полуинактивации составляло 4,8 мин. Введение животным фосфолипидных препаратов приводило к замедлению инактивации цитохрома Р450, наиболее выраженный стабилизирующий эффект имел место в случае использования исследуемой композиции (время полуинактивации составляло 18 мин и приближалось к таковому для интактных животных).

3) Изучение влияния фосфолипидных препаратов на ферментный состав и N-деметилазную и n-гидроксилазную активности в микросомах печени крыс с токсическим гепатитом после введения животным фосфолипидных препаратов.

Для оценки репарирующего эффекта фосфолипидных препаратов в мембранах микросом печени 3-х экспериментальных групп крыс (см. выше) в суспензии микросом определяли содержание цитохрома Р450, активности НАДФН-цитохром с редуктазы, НАДН-феррицианид редуктазы и N-деметилазную и n-гидроксилазную активности с использованием аминопирина и анилина, соответственно.

Определение содержания цитохрома Р450 в микросомах основано на измерении величины поглощения комплекса восстановленного цитохрома Р450 с СО при 450 нм (J.Biol.Chem. v.239, р.2370-2378, 1964). Активность НАДФН-цитохром с редуктазы определяли по скорости восстановления цитохрома с при 550 нм, активность НАДН-феррицианид редуктазы по скорости восстановления феррицианида калия при 420 нм (Вiochemistry, v.16, р.1116-1123, 1977). N-деметилазную активность в микросхемах определяли по количеству образовавшегося в реакции окисления аминопирина формальдегида, выявляемого по образованию окрашенного продукта в присутствии реактива Наше при 412 нм (Аrch.Biochem.Bioрhys. v. 298, р.403-412, 1992). n-Гидроксилазную активность определяли по количеству образовавшегося при окислении анилина n-аминофенола, выявляемого колориметрически по реакции с фенолом и Nа₂СО₃, при 630 нм (Аrch.Вiochem.Вiорhys. v. 298, р.403-412).

Данные по определению в микросомах 3-х групп, указанных выше параметров, приведены в табл.4. Показано, что при токсическом гепатите происходит падение содержания цитохрома Р450, активности редуктаз и активности деметилазы и гидроксилазы. Введение животным с гепатитом фосфолипидных препаратов приводило к увеличению величин исследуемых параметров и они приближались к величинам для микросом из группы интактных животных. Таким образом, предложенная композиция обладает способностью реактивировать ферментные системы после инактивации их при токсическом гепатите.

4) Изучение влияния фосфолипидных препаратов на активность ферментов сыворотки крыс с токсическим гепатитом после введения животным фосфолипидных препаратов.

Для оценки биологической активности фосфолипидных препаратов в сыворотке крови 3-х групп экспериментальных животных определяли активность аспартат- и аланин-трансфераз, щелочной фосфатазы и гамма-глютамилтрансферазы, по уровню активности которых определяют функциональное состояние печени. При многих заболеваниях печени уровень активности данных ферментов в сыворотке резко возрастает. Активность ферментов определяли с использованием стандартных наборов Воehringer Маnheim (Германия) на автоанализаторе FР-90 Labsystem (Финляндия).

Данные по определению активности указанных ферментов представлены в табл. 5. Видно, что по сравнению с контрольным уровнем при гепатите происходит резко увеличение активности данных ферментов с сыворотке крови, что говорит о повреждении органа. Введение животным фосфолипидных препаратов сопровождается снижением активности печеночных ферментов и их уровень становится сравнимым с таковым для интактных крыс. Следовательно, заявляемая композиция обладает высокой биологической активностью и способствует нормализации функционального состояния пораженной печени.

5) Изучение влияния фосфолипидных препаратов на выживаемость крыс с токсическим гепатитом после введения животным фосфолипидных препаратов.

Токсический гепатит и введение фосфолипидных препаратов осуществляли как указано выше (см. пункт 2). Как видно из табл.6 в группе крыс с токсическим гепатитом погибало 40% животных, введение фосфолипидных препаратов увеличивало выживаемость животных и она составляла 90-95% от общего количества крыс в группе.

Таким образом, заявляемая композиция обладает способностью реактивировать и репарировать мембранные ферментные системы печени, улучшает ее функциональное состояние и увеличивает выживаемость животных при токсическом поражении печени.