способ выделения пыльников сои

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЫЛЬНИКОВ СОИ, включающий отбор, стерилизацию бутонов, гомогенизацию в жидкой среде, предварительную фильтрацию через сито, отличающийся тем, что после фильтрации осуществляют последующую электрофлотацию при напряженности электрического поля 1 10 В/см.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии.

Известен способ выделения пыльников сои, заключающийся в том, что отделение пыльников от соматической ткани проводят путем предварительной фильтрации через сито с последующей флотацией. Недостатком данного способа является невысокая степень очистки и большие потери пыльников во время флотации, что связано с невозможностью добиться соответствия размеров пузырьков газа размерам пыльников.

Сущность изобретения заключается в том, что отбирают бутоны, стерилизуют в 0,1%-ном растворе HgCl₂ в течение 10 мин, помещают их в емкость с жидкостью, осмотическое давление которой равно или близко к осмотическому давлению внутри микроспор, например физиологический раствор (8,5 г/л NaCl), измельчают с помощью миксера, проводят на сите первичную очистку пыльников от соматической ткани и отделяют измельченную ткань бутонов от пыльников электрофлотацией, затем переносят пыльники на сито, где их промывают свежим физиологическим раствором (8,5% г/л NaCl). При этом повышается качество очистки пыльников и снижаются их потери в процессе выделения за счет того, что размер пузырьков газа при электрофлотации соответствует размеру пыльников сои. В этом случае не происходит слияния пузырьков газа между собой, так как на своей поверхности каждый из них несет некоторый заряд одного знака.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Растения сои в фазе цветения начало бобообразования с корнем помещают в сосуды с жидкой питательной средой Кнопа и выдерживают в холодильнике при температуре 0-10^оС в течение 3-30 дней. При температуре 0-10^оС пыльники, достигнув фазы 1-2 ядерных микроспор, останавливаются в своем развитии, за счет чего в дальнейшем повышается процент формирования каллуса из пыльника. Время темпеpатуpной предобработки (3-30 дней) обеспечивает достижение фазы 1-2 ядерных микроспор большим количеством пыльников. Затем пинцетом отделяют бутоны и стерилизуют их в 0,1%-ном растворе HgCl₂ в течение 10 мин. Всю дальнейшую работу ведут с соблюдением условий асептики. После стерилизации бутоны дважды отмывают в 500 мл дистиллированной воды в течение 10-15 мин, затем помещают в емкость с жидкостью, осмотическое давление которой близко или равно осмотическому давлению внутри микроспор (5-10 атм.), например физиологический раствор (8,5 г/л NaCl), чтобы не происходило разрушение пыльников и измельчают с помощью мешалки РТ-2 или миксера при 5000 об./мин в течение 10-15 мин. Затем отделяют измельченную ткань бутонов от пыльников электрофлотацией, которую проводят при напряженности электрического поля 1-10 В/см, так как при меньшей напряженности электрического поля образуется недостаточное количество пузырьков газа, а при более высокой напряженности электрического поля происходит чрезмерное перемешивание раствора, что приводит к ухудшению качества разделения. Отделенные пыльники помещают на сито с отверстиями менее 0,1 мм (меньше размера пыльников) и отмывают от примесей диплоидных клеток бутонов свежим физиологическим раствором. После чего очищенные пыльники используют для посадки в культуру или иных целей.

П р и м е р 1. Выделенные на сите пыльники сои сорта "Рассвет" помещают в физиологический раствор в кювету для электрофореза вблизи анода. Включают электрический ток напряженностью 1 В/см. При этом наблюдается выделение пузырьков газа на аноде. Выделившиеся пузырьки захватывают из взвеси пыльники и поднимают их к поверхности. Но данная напряженность электрического поля приводит к недостаточному выделению пузырьков газа и к увеличению длительность процесса электрофлотации.

П р и м е р 2. Условия по примеру 1, но напряженность электрического поля 5 В/см. При этом выделение пыльников проходило достаточно быстро (10-15 мин) и качество очистки достаточно высокое, а загрязненность не превышает 10% Потери пыльников при электрофлотации не превышают 20%

П р и м е р 3. Условия по примеру 1, но напряженность электрического поля 10 В/см. При этом происходит интенсивное выделение газа на аноде, что приводит к перемешиванию жидкости и попаданию загрязняющей соматической ткани к пыльникам. Это снижает качество очистки пыльников. Потери пыльников в этом случае незначительны.

Изобретение позволяет значительно (в 2-3 раза) повысить качество очистки пыльников сои по сравнению с флотацией и снизить при этом потери пыльников.