фрагмент днк нс365, полипептид, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида, обладающего способностью связывать антитела к вирусу гепатита c

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК НС-365, полученный с помощью искусственного химического синтеза или цепной полимеразной реакции с нуклеотидной последовательностью

GATCCCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAAACAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGG ACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACGTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGG TTGGGTGTGCGCGCGCCCAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGGCGACAACC TATCCCCAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGCAAGAGCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCTCT CTATGGCAATGAGGGCTTAGGGTGGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGCGGCTCCCGGCCTA GTTGGGGCCCCACGGACCCCCGGCGTAGGTAATAATAGCTGCA, содержащий на 3 конце стоп-кодон.

2. Полипептид, полученный в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном рекомбинантной плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, соответствующую следующей аминокислотной последовательности:

X-DPMSTNPK PQRKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGPRLGVRAPRK TSERSQPRGRRQPIPKARRPEGKSWAQPGYPWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSW GPTDPRRR, где X-аминокислотная последовательность бета-галактозидазы E.coli, обладающей способностью связывать антитела к продукту гена Cor-антигена вируса гепатита C и вызывать образование специфических антител к Cor-антигену вируса гепатита C после введения лабораторным животным.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ N B-6594 продуцент полипептида, обладающего способностью связывать антитела к вирусу гепатита C.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С.

Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит A, гепатит B, гепатит D, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение вирусом гепатита С, как правило, осуществляется при переливании крови. Вирус гепатита С при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит B. Однако показано, что почти у 50% пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у 20% хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени. Поэтому для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять людей, инфицированных вирусом гепатита С.

Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. Вирус гепатита С имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Геном содержит единственную открытую рамку считывания, перекрывающую большую часть вирусного генома, и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010-3011 аминокислотных остатков, являющийся предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков. К структурным белкам вируса гепатита С относятся Cor (ядерный)-антиген (мол. м. 19 кДа) и два гликопротеина с мол.м.32 кДа и 72 кДа. Все они процессируются с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид вируса гепатита С. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита С, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита С (NS1). Белок NS2 вируса гепатита С размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 (размером 60 кДа) обладает нуклеотидтрифосфатсвязывающей геликазной активностью и ферментативной активностью сериновой протеазы.

Он участвует как в репликации вирусного генома, так и в процессинге неструктурных белков вируса гепатита С. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа, соответственно. Как и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5 многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, участвуя таким образом в репликации вирусного генома.

Большинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита С основано на определении антител к белкам вируса гепатита С в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита С, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вируса гепатита С, вместо виррусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков продуктов генов вируса гепатита С, в том числе и Cor-антигена (патенты ЕР 0445423 А2, кл. G 01 N 33/576 1990; ЕР 0419182 А1, кл. C 12 N 5/51, 1990; EP 0388232 A1, кл. C 12 N 5/51, 1990; ЕР 0406511 А1, кл. С 12 N 5/51, 1990; EP 0416725 A2, кл. C 12 N 5/51, 1990 и др.).

В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕР 0388232), так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант (ЕР 0445423) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов вируса гепатита С (ЕР 0377303 A1, кл. C 12 N 5/51, 1989).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложены оригинальные, искусственно созданные полипептиды, состоящие из продукта экспрессии фрагмента генома вируса гепатита С, свободные или слитные с бета-галактозидазой E. coli, связывающие антитела к продукту гена Cor-антигена вируса гепатита С, фрагмент ДНК НС365, штаммы E.coli НС117 ВКПМ N 6594 и N 6595, трансформированные рекомбинантными плазмидами pHC365 или pHC365F, содержащими фрагмент ДНК НС365.

Штаммы-продуценты характеризуются следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина.

При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32^оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37^оС, при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^оС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10⁶ кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^оС в течение 5-6 месяцев.

Полипептиды, выделенные и очищенные из штаммов продуцентов, иммобилизованные на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывают антитела к продуктам гена Cor-антигена вируса гепатита С в сыворотках крови и других биологических жидкостях.

Штаммы депонированы в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов ВКПМ N 6594 и N 6595.

П р и м е р 1. Получение фрагмента ДНК НС365.

Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды:

cr1 5" GATCCCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAA 3"

cr2 5" CAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTC 3"

cr3 5" CCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACGTGTTGCCGCGCAGG 3"

cr4 5" GGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGCCCAGGAAGACTC 3"

cr5 5" CGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGGCGACAACCTATCCC 3"

cr6 5" CAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGCAAGAGCTGGGCTCAGCCCGGGTAC 3"

cr7 5" CCTTGGCCTCTCTATGGCAATGAGGGCTTAGGGTGGG 3"

cr8 5" CAGGATGGCTCCTGTCACCCCGCGGCTCCCGGCCTAGTTGGGGCCCCACG 3"

cr9 5" GACCCCCGGCGTAGGTAATAATAGCTGCA 3"

rc1 5" GCCCGGGAACTTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGTTTTTТCTTTGAGGTTTA

GGATT CGTGCTCATGG 3"

rc2 5" GGCCCCTGCGCGGCAACACGTAAACTCCACCAACGATCTGACCACC 3"

rc3 5" GAGGTTGCGACCGCTCGGAAGTCTTCCTGGGCGCGCGCACACCCAACCTGG 3"

rc4 5" CCGGGCTGAGCCCAGCTCTTGCCCTCGGGCCGGCGAGCCTTGGGGATAGGTTGTCGCCTTC

CAC 3"

rc5 5" GAGCCATCCTGCCCACCCTAAGCCCTCATTGCCATAGAGAGGCCAAGGGTAC 3"

rc6 5" CCGGGGTCCGTGGGGCCCCAACTAGGCCGGGAGCCGCGGGGTGACAG 3"

rc7 5" GCTATTATTACCTACG 3"

Олигонуклеотиды cr 1,2,3,4,5,6 и rc 1,2,3,4 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмоль каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл десятикратного буфера для киназы (0,5М трис-HCl, рН 7,6, 0,1 М MgCl₂ 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмоль (150 мкКи) [гамма-³²Р]АТФ (удельная активность 3000 Ки/ммоль), 150 ед. активности полинуклеотидкиназы фага Т4, бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 мин при 37^оС. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98^оС, охлаждают до 16^оС и обрабатывают ДНК-лигазой. Для этого 100 мкл смеси обработанных киназой олигонуклеотидов смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66 М трис-НCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl₂, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), добавляют 8 мкл (50 ед. активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4^оС в течение 5 ч. Затем реакционную смесь прогревают при температуре 65^оС в течение 15 мин для инактивирования фермента.

10 мкл раствора олигонуклеотидов, обработанных киназой и лигазой, используют для анализа полученной ДНК методом электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). После радиоавтографии геля виден фрагмент размером около 250 п.н.

100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и KpnI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол) в течение 5 ч при температуре 37^оС. Ферменты инактивируют нагреванием при 70^оС.

10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 250 п.н.).

ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК вносят в эппендорфовскую пробирку, содержащую 7 мкл (0,1 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами BamHI и KpnI, 2 мкл десятикратного буфера для лигирования, 1 мкл (5 ед. активности) ДНК-лигазы фага Т4, и инкубируют при 4^оС в течение 5 ч.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2%-ным LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами BamHI и KpnI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Отбирают штамм HCBK1. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HCBR имеет на электрофорегррамме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 249 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК.

Олигонуклеотиды cr 7,8,9 и rc 5,6,7 смешивают и обрабатывают последовательно полинуклеотидкиназой и ДНКА лигазой фага Т4, как описано выше.

100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами PstI и KpnI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол) в течение 5 ч при температуре 37^оС. Ферменты инактивируют нагреванием при 70^оС.

10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 116 п.н.).

ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК вносят в эппендорфовскую пробирку, содержащую 7 мкл (0,1 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами PstI и KpnI, 2 мкл десятикратного буфера для лигирования, 1 мкл (5 ед. активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4^оС в течение 5 ч.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5альфа. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами PstI и KpnI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Отбирают штамм HCPK1. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HCKP1 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 116 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК.

Плазмидную ДНК из штаммов HCBK1 и HCKP1 используют для получения фрагмента ДНК HC365. Для этого бактериальные клетки штаммов HCBK1 и HCKP1 лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК pHCBK1 обрабатывают рестриктазами BamHI и KpnI, а ДНК pHCKP1 обрабатывают рестриктазами PstI и KpnI. Продукты гидролиза фракционируют в полиакриламидном геле и выделяют фрагменты ДНК размером 116 п.н. (фрагмент КР) и 249 п.н. (фрагмент BK) по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Изолированные фрагменты ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды.

По 5 мкл фрагментов ДНК BK и KP лигируют с ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами PstI и BamHI.

Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5альфа. Клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами PstI и BamHHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Отбирают штамм HCBP1. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HCBP имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 (ДНК плазмиды pUC18) и 360 п.н. (фрагмент ДНК HC360).

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК НС360:

GATCCCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAAACAAACGTAACACCAACCGCCGC CCACAGGACGTCAAGTТCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACGTGTTGCCG CGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGCCCAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCT CGTGGAAGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGCAAGAGCTGGGCTCAG CCCGGGTACCCTTGGCCTCTCTATGGCAATGAGGGCTTAGGGTGGGCAGGATGGCTCCTG TCACCCCGCGGCTCCCGGCCTAGTTGGGGCCCCACGGACCCCCGGCGTAGGTAATAATAG CTGCA

Аналогичный фрагмент ДНК НС365 также был получен путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc7.

П р и м е р 2. Получение плазмид.

Фрагмент ДНК НС365 лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A, обработанной рестриктазами BamHI и PstI.

Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT190. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1%-ным LB-агаром, содержащие 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2% -ной агарозе. Отбирают штамм НС117. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма НС117 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 365 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС365.

При определении нуклеотидной последовательности плазмиды pHC365 установлено, что синтезированный фрагмент гена Cor-антигена вируса гепатита С через BamHI сайт присоединен к 3"-концу гена бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида pHC365 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности Cor-антигена вируса гепатита С, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.

Аналогичным образом получена плазмида pHC365F, в которой фрагмент ДНК НС365 находится непосредственно под контролем промотора бактериофага лямбда rcoLacZ. Полученная плазмидная ДНК обеспечивает синтез рекомбинантного Cor-антигена вируса гепатита С, свободного от аминокислотных последовательностей бета-галактозидазы E.coli.

П р и м е р 3. Синтез полипептида.

Штаммы E.coli, содержащие плазмиды pHC365 или pHC365F, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 40^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кДа. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLT190, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий плазмид pHC365 или pHC365F. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штаммы E.coli, содержащие плазмиды pHC365 или pHC365F, экспрессируют полипептиды с мол.м.150-160 кДа или 18-19 кДа соответственно. Аминокислотные последовательности полипептидов, определенные на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, представлены ниже:

X D P M S T N P K Q R K N K R N T N R R P Q D V K

F P G G G Q I V G G V Y V K P R R G P R L G V R A P

R K T S E R S Q P R G R R Q P I P K A R R P E G K S

W A Q P G Y P W P L Y G N E G L G W A G W L L S P R

G S R P S W G P T D P R R R,

где Х ноль или аминокислотная последовательность бета-галактозидазы E.coli.

П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности полипептидов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24 В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15 М NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^оС обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к вирусу гепатита С, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^оС в течение 1 ч.

Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полученные полипептиды связываются с антителами к вирусу гепатита С.

П р и м е р 5. Получение специфических антител к Cor-антигену вируса гепатита С.

Штаммы E.coli, содержащие плазмиды pHC365 или pHC365F, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 40^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки фракционируют в 10% ПААГ по стационарному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кДа. По обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982) из геля выделяют мажорный белок с мол.м.150-160 кДа.

По 3 мг очищенных с помощью гель-электрофореза полипептидов используют для иммунизации 3-6 месячных самок мышей BALB/c. Белок вводят внутрибрюшинно с интервалом 2 недели с полным адъювантом Фрейнда (при первых двух иммунизациях) и неполным адъювантом Фрейнда (при последующих двух иммунизациях). Выявление антител к Cor-антигену вируса гепатита С в сыворотках крови иммунизированных животных проводят с помощью вестерн-блот-анализа. Для этого через две недели после последней иммунизации у животных берут кровь и получают сыворотку, используя стандартные методы (DNA cloning, Oxford, 1987). Затем фракционируют плазму крови больных гепатитом С методом электрофореза в полиакриламидном геле и белки переносят на нитроцеллюлозный фильтр. Блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками, обработку сыворотками животных, иммунизированных рекомбинантными белками, выявление специфических антител с помощью антивидового конъюгата, отмывки проводят, как описано в примере 4. Анализ показывает, что сыворотки животных, иммунизированных полипептидами, содержат антитела, которые специфически взаимодействуют с Cor-антигеном вируса гепатита С (полипептид с мол.м.19 кДа).

Таким образом, объектом защиты данного изобретения являются полипептиды со свойствами внутреннего антигена вируса гепатита С, взаимодействующие с антителами к Cor-антигену вируса гепатита С, способные вызывать образование специфических антител к Cor-антигену вируса гепатита С после введения лабораторным животным.