способ диагностики злокачественного заболевания и его рецидива

Формула изобретения

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ И ЕГО РЕЦИДИВА,включающий определение в биологической пробе магний независимой ДНК- азной активности при pH 5,0 5,7 и уровня компонентов кислотно- растворимой фракции при 260 нм, отличающийся тем, что в качестве биологической пробы берут пробу мочи натощак, при этом за сутки и более пациента ограничивают в потреблении алкоголя, животных белков и продуктов, влияющих на суточный диурез, и при обнаружении магнийнезависимой ДНК-азной активности и уровне компонентов кислотно-растворимой фракции мочи ниже 0,300Е диагностируют злокачественное заболевание без метастазирования или его рецидив, а при уровне компонентов кислотно-растворимой фракции, равном 0,300 Е и более, без магнийнезависимой ДНК азной активности злокачественное заболевание с метастазированием или его рецидив.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической онкологии, и может быть использовано при диспансеризации населения как взрослых, так и детей для выявления больных со злокачественным процессом независимо от его локализации, а также для обследования онкологических больных, взрослых и детей с подозрением на наличие у них рецидива заболевания.

Известен способ ранней диагностики рака, основанный на том, что экстракт, полученный после соответствующей обработки мочи, спектрофотометриpуют в области 500-580 нм и при наличии максимального поглощения, превышающего 0,1 единицы оптической плотности, диагностируют рак (авт.св. N 1475332, кл. G 01 N 33/48, 1988).

Данный способ широкого практического применения не нашел, так как с его помощью из всех видов злокачественных заболеваний (рак, саркома, системные злокачественные заболевания) можно выявить только рак и только в начальных его стадиях I-II. Стадии III-IV по своим показателям не отличаются от показателей здоровых лиц. Такой способ диагностики рака не пригоден для достаточно эффективной диспансеризации населения, а также для выявления рецидива заболевания у онкологических больных.

Известен способ определения стадий злокачественного процесса, благодаря которому появилась возможность устанавливать наличие рака в любой стадии злокачественного процесса (кроме его рецидива) путем определения в сыворотке крови магнийнезависимых ДНКазной активности при рН 5,0-7,5 и показателя количественного содержания перхлорнораст- воримых компонентов кислоторастворимой фракции крови (КФК), спектрофотометрически при 260 нм.

При определении магнийнезависимой ДНКазной активности и нормального или повышенного показателя количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции в сыворотке крови определяют наличие злокачественного процесса независимо от его локализации.

При отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания компонентов кислотораствори- мой фракции в сыворотке крови до 0,118 и более определяют наличие запущенного злокачественного процесса с метаста- зированием.

При отсутствии магнийнезависимой ДНКазой активности и неизменном показателе количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции в сыворотке крови ( 0,117 ) определяют отсутствие злокачественного процесса, чувствительность способа, т.е. способность выявить наличие злокачественного процесса в начальных стадиях развития или в запущенных случаях с метастазированием, высока и составляет 96% что позволяет его использовать с этой целью при поликлиническом обследовании больных.

Однако этот способ также обладает недостатками:

получение биологического материала для исследования по данному способу, т. е. сыворотка крови, связано с весьма болезненным и травматичным внутривенным взятием крови, требующим к тому же добавочного использования труда квалифицированного медработника. Это же обстоятельство сильно затрудняет использование способа при обследовании детей;

активность магнийнезависимых ДНКаз в сыворотке крови проявляется весьма слабо и поэтому выражается обычно в небольших относительных единицах оптической плотности (см.табл.1) от 0,20-0,064 . Иногда ее величина находится уже на границе чувствительности метода (0,019-0,020 ), когда необходима повторная проверка этой величины, т.е. повторный анализ;

повышение показателя количественного содержания компонентов кислотно-растворимой фракции в сыворотке крови (КФК) является недостаточно информативным в отношении определения наличия метастазирования, так как может происходить и в начальных стадиях ракового процесса, правда, на фоне повышения ферментативной активности магнийнезависимых ДНКаз крови;

данный способ нельзя использовать для выявления рецидива злокачественного заболевания, так как в половине случаев в сыворотке крови характерные изменения не выявлены (см.табл.2).

Целью изобретения является использование для диагностического анализа простого безболезненного забора доступного биологического материала, а также расширение границ информативности и эффективности способа.

Это достигается тем, что в качестве исследуемого материала используют свежую утреннюю мочу, взятую натощак, в которой определяют магнийнезависимую кислоту ДНКазную активность при рН 5,3-5,7 и показатель количественного содержания компонентов кислотно-растворимой фракции мочи (КФМ) спектрофотометрически при 260 нм.

При обнаружении в моче магнийнезависимой ДНКазной активности и нормальном ниже 0,300 содержании компонентов кислоторастворимой фракции определяют наличие злокачественного заболевания или его рецидива. При отсутствии в моче магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении в ней количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции до 0,300 и более определяют наличие злокачественного заболевания с метастазированием или его рецидива.

При отсутствии в моче магнийнезависимой ДНКазной активности и нормальном количественном содержании компонентов кислоторастворимой фракции определяют отсутствие злокачественного заболевания или его рецидива у практически здоровых лиц и у больных с доброкачественными новообразованиями, а также с хроническими воспалительными процессами.

В предлагаемом способе используют безболезненно и легко получаемый биологический материал мочу в отличие от сыворотки крови, требующей травматичного и сложного забора крови из вены.

Определяемая в моче активность магнийнезависимых кислых ДНКаз превышает ферментативную активность аналогичных ДНКаз в сыворотке крови (прототип) на порядок, т. е. в 10 раз, и выражается в более высоких единицах оптической плотности: 0,022-0,100 в отличие от 0,020-0,064 (см.табл.1), так как для анализа сыворотку крови разбавляют в 10 раз, мочу в предлагаемом способе в 100 раз.

Биохимическое различие в активности магнийнезависимых ДНКаз мочи и сыворотки крови, выражающееся также и в различных пределах рН, в которых может выявляться эта активность: для мочи очень ограниченные пределы рН 5,3-5,7, а для сыворотки крови широкие рН 5,0-7,5, указывает на то, что магнийнезависимые кислые ДНКазы мочи и крови отличаются по своему химическому составу, т.е. относятся к различным веществам.

Повышение показателя количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции мочи (КФМ) обладает высокой информативностью, так как происходит только при наличии запущенного злокачественного процесса с метастазиро- ванием и не имеет места в начальных (без метастазов) I-II-III стадиях рака (см.табл.1). Относительные величины оптической плотности, в которых выражается этот показатель, в моче в 2 и более раз превышают аналогичные в сыворотке крови, в норме и в патологии.

Предлагаемый способ имеет расширенные границы информативности благодаря его возможности выявлять наличие рецидивов злокачественных заболеваний: или по возрастанию выше нормы показателя количественного содержания компонентов КФМ, или по выявлению активности кислых магнийнезависимых ДНКаз в моче онкологического больного, находившегося после лечения в состоянии ремиссии (см.табл.2). С помощью этого способа можно выявлять также саркомы и системные злокачественные заболевания.

Изобретение практически широко применимо, так как простота, удобство, дешевизна выполнения способа позволяют использовать его при профилактических массовых обследованиях населения и в клинических условиях и при этом не только взрослых, но и детей.

Изобретение выполняется следующим способом.

Процедура проведения анализа:

Условия, ограничивающие проведение анализа: постоянное употребление алкоголя; во время стрессового состояния обследуемого (например, в день операции и т. д. ); проведение в ближайшие 5-6 месяцев перед анализом химио-, лучевой или фитотерапии, самолечения ядами (сулема, креолин и др.) или лечения биологически активными веществами (гормоны, нуклеотиды, адантогены и др. ).

Для получения правильного результата анализ мочи можно проводить только при соблюдении следующих требований:

за 12 ч до разовой сдачи свежей мочи на анализ нельзя ничего есть и пить (даже просто воду!);

в предшествующие анализу сутки необходимо употреблять в пищу ограниченные количества животных белков, а также не употреблять в больших количествах фрукты, овощи и их соки, соленую рыбу, т.е. продукты, влияющие на суточный диурез, животные белки в свою очередь могут повлиять на величину КФМ;

в ближайшие 2-3 суток не употреблять алкоголь;

за сутки до анализа не принимать лекарств, особенно: гипотензивные средства, анальгетики и др.

Подготовка анализа.

Свежевыпущенную утреннюю мочу, взятую натощак перед самым анализом, центрифугируют 30 мин при 1500 об./мин, сливают с осадка и 1 мл ее разводят физраствором в 100 раз: разведенную мочу сохраняют во время анализа на ледяной бане, на которую ставят все реактивы, сохраняемые в холодильнике, на ней же проводят весь анализ;

0,05% -ный раствор ДНК-а соли (субстрат для ферментов) готовят extempore на 0,1 М ацетатном буфере рН 5,3-5,7 в течение 1 ч, а затем щадяще центрифугируют и держат на ледяной бане.

Проведение анализа.

Разлив реактивов производят в следующем составе и порядке:

контроль I (на содержание свободных нуклеотидов в 0,05%-ном растворе субстрата). К 1 мл физраствора приливают 1 мл 0,05%-ного раствора субстрата;

контроль II (на определение количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции мочи (КФМ). К 1 мл 0,1 М ацетатного буфера приливают 1 мл разбавленной в 100 раз мочи;

опыт. К 1 мл 0,05%-ного раствора субстрата приливают 1 мл разбавленной в 100 раз мочи.

Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают встряхиванием и инкубируют 30 мин на водяной бане при 37^оС.

Останавливают ферментативную реакцию путем быстрого помещения всех проб в ледяную баню и быстрого добавления в каждую пробу по 1 мл ледяного раствора HClО₄ (до конечной концентрации в реакционной смеси 0,5 М HClO₄). После тщательного встряхивания пробы оставляют на 1 ч в ледяной бане для лучшего формирования осадка. Затем центрифугируют при 4000 об./мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и спектрофотометрируют при 260 нм.

Расчет магнийнезависимой ДНКазной активности мочи и показателя количественного содержания в ней компонентов кислоторастворимой фракции (КФМ):

Рассчитывают истинную оптическую плотность, характеризующую ферментативную активность в опытных пробах (_o) путем вычитания из среднеарифметического показателя оптической плотности опытных проб суммы среднеарифметических показателей оптических плотностей проб обоих контролей по формуле: _o=_o-(_KI+_KII).

ДНКазную активность удобно выражать в условных единицах, т.е. в величинах оптической плотности в экстинкциях ().

Обнаружение положительной ферментативной активности следует считать со значения _o 0,021-0,022 и выше, так как граница чувствительности метода 0,015-0,020 (с учетом расхождения в параллельных пробах ( 0,010 -0,015 ) и возможной ошибки прибора ( 0,005 ).

Показателем количественного содержания компонентов фракции мочи (КФМ) служит среднеарифметический показатель оптической плотности контроля II, выраженный в экстинкциях (), т.е. в условных единицах.

В виду того, что величина показателя КФМ может измениться из-за неспецифически измененного диуреза у обследуемого лица при несоблюдении им изложенных требований в отношении диуретически влияющих агентов: питье воды, пищевых, лекарственных и др. уменьшающих показатель КФМ, одновременно с анализом мочи можно рекомендовать попутно определять аналогичный количественный показатель содержания компонентов КФК в сыворотке крови, взятой из пальца в то же время после взятия мочи. Этот показатель от диуретиков не изменяется. Однако он не всегда адекватен диагнозу, например, в табл. 2 представлены случаи рецидива (1-й, 2-й, 3-й), которые по крови определить не удалось бы, в то время как КФМ или _o в моче возрастали.

Показатель количественного содержания компонентов кислоторастворимой фракции крови (КФК) не сложно определять одновременно с анализом мочи, предварительно взяв 0,4 мл крови из пальца микропипеткой и разбавив ее в 10 раз физраствором до 4 мл.

После центрифугирования в тех же условиях как и для мочи, надосадок разбавленной сыворотки крови отсасывают и сохраняют на ледяной бане.

Одновременно с пробами мочи готовят 3-й контроль на КФК (3 параллели): К 1 мл ацетатного буфера, используемого и для мочи, приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки крови, полученной из пальца. В дальнейшем все манипуляции с пробами те же, что и с пробами мочи, расчет тот же.

В норме количественное значение показателя КФК должно быть ниже 0,118 , а КФМ должно быть ниже 0,300 .

П р и м е р 1. Больная Т. 1941 г. рождения, ист.болезни N 104/Ю, прооперирована в гинекологическом отделении Ростовского НИИ онкоинститута с диагнозом: рак тела матки, стадия I-II, гистоанализ: высокодифференцированная аденокарцинома с инвазией в мышечный слой (N гистоанализа 271054-061). Диагностический анализ мочи до операции от 08.02.90. ДНКазная активность 0,100 , показатель КФМ (кислоторастворимая фракция мочи) 0,270 . Параллельно выполнен анализ крови по известному способу (прототип): 0,023 , показатель КФК 0,072 .

П р и м е р 2. Больная З. 1924 г. рождения, ист.болезни N 3634/Я, прооперирована в гинекологическом отделении Ростовского НИИ онкоинститута с диагнозом: рак яичников, IV стадия с метастазами; гистоанализ: цистаденокарцинома с метастазами в большой сальник (N гистоанализа 301983-89). Диагностический анализ мочи до операции от 04.04.91 г. ДНКазная активность 0; показатель КФМ 0,438 Параллельно выполняли анализ крови (прототип): 0; КФК 0,280 .

П р и м е р 3. Больная З. 1954 г. рождения, ист.болезни N 11808/Ю, прооперирована в отделении мамалогии Ростовского НИ онкоинститута с диагнозом фиброзно-кистозная мастопатия левой молочной железы (N гистоанализа 279137), диагностический анализ мочи до операции от 19.10.90 ДНКазная активность мочи 0, показатель КФМ 0,219 .

Доброкачественный процесс и показатели соответствуют норме.

Предлагаемым способом были обследованы практически здоровые лица 38 человек, лица группы повышенного риска по раку (доброкачественные опухоли и хронические воспалительные процессы) 51 человек и больные со злокачественным процессом, включая рецидивы 75 человек (см.табл.1).

В табл.1 приведены количественные показатели (в условных единицах оптической плотности ) активности магнийнезависимых ДНКаз мочи и компонентов кислоторастворимой фракции мочи (КФМ) у всех перечисленных лиц в сравнении с аналогичными показателями в крови, полученными известным способом (прототипом).

Согласно данным этой таблицы, предлагаемый способ характеризуется следующими показателями для трех групп обследованных лиц:

у практически здоровых лиц (группа I) ни в моче, ни в крови активность магнийнезависимых кислых ДНКаз не обнаруживается, КФМ и КФК на уровне нормы, соответственно <0,300 и <0,118.
группы I и II по своим показателям резко отличаются от группы III (со злокачественными заболеваниями: раки, саркомы, системные злокачественные процессы (лим- фосаркома); При I и II и частично III стадиях рака (без метастазирования) в моче и в крови обнаруживается активность ДНКаз, но при этом только в моче показатели КФМ остаются в норме, указывая на отсутствие метастазов, а в крови КФК такой информативностью не обладает, так как может быть и в норме и выше нее, в III-IV стадиях чаще всего активность магнийнезависимых ДНКаз не выявляется, исключение наблюдают в локализациях желудочно-кишечного тракта, легких, однако показатель КФМ в моче всегда при наличии метастазов выше или равен 0,300 ; при саркомах, рецидивах, лимфосаркоме активность ДНКаз в моче может как выявляться, так и не выявляться, но при этом величина показателя КФМ чаще бывает выше нормы (когда нет активности ДНКаз) или снижается до нормы, если эта активность обнаруживается.

В табл. 2 приведены те же показатели, полученные при обследовании пяти онкологических больных с рецидивом заболевания.

Доказательства положительного эффекта предлагаемого способа представлены в табл.3, на основании данных которой выведены критерии оценки предлагаемого способа в сравнении с прототипом (табл.4).

Как видно по данным табл.4, диагностическая эффективность предлагаемого способа по правильному выявлению злокачественного процесса или его рецидива и лиц без него, достаточно высока и составляет 91% Диагностическая специфичность более высока, чем в прототипе, а чувствительность, как в прототипе говорит о высокой степени выявляемости онкологических заболеваний. Однако предлагаемый способ отличается доступностью и простотой получения исследуемого биологического материала мочи, а также большей чем прототип информативностью в отношении определения наличия рецидивов онкозаболеваний и запущенности злокачественного процесса.

Так, изменения показателя количества компонентов КФМ в моче, в отличие от аналогичного показателя КФК в крови, могут быть более информативно использованы для характеристики запущенности первичного злокачественного процесса (метастазирование).

Технический результат способа выявления злокачественного заболевания и наличия его рецидива заключается в том, что исследование мочи пациента в качестве доступного биологического материала упрощает способ, делает его более удобным, безболезненным. Выполнение способа не требует дорогостоящей, сложной технической аппаратуры, больших материальных затрат и рабочего времени медперсонала. Высокая диагностическая эффективность и чувствительность, большая информативность, простота исследуемого материала и выполнения исследования делают способ очень перспективным в отношении использования для диспансеризации населения и для онкологического обследо- вания детей.