способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ И БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ, включающий экстракцию липополисахарида из бруцелл вида abortus обработкой 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% -ного раствора NaCl при автоклавировании, отделение экстракта центрифугированием, фракционирование супернатанта спиртом, выделение О-полисахарида из полученного осадка с последующей его очисткой, отличающийся тем, что выделение О-полисахарида осуществляют трихлоруксусной кислотой на холоду в течение 15 мин, а очистку проводят гель-фильтрацией в агарозе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в ветеринарной практике для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Известен способ получения полисахарида В (поли В), используемого для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных [1]

Способ включает ресуспендирование клеток Brucella melitensis B H₂O, осаждение полисахаридов, белков и липосахаридов трихлоруксусной кислотой, последующее осаждение их спиртом, отделение преципитата, центрифугирование и лиофилизацию.

Выход составляет 0,4-0,5% от исходного веса сухой микробной массы. Преципитат поли В содержит 80% общих углеводородов, 5% белка.

Недостатком данного способа является то, что осаждение трихлоруксусной кислотой на первом этапе приводит к выделению в конечном продукте преимущественно липополисахаридов, белков, являющихся общими для всех бруцелл, и частичной потере активного антигена, что обусловливает низкий выход антигена. Низкий выход активного антигена не позволяет практически использовать данный способ в ветеринарной практике.

Известен также способ получения О-цепи полисахаридов, наиболее близкий к заявляемому по технической сущности (прототип) [2] Для получения антигена используют клетки бруцелл рода Brucella abortus. Способ включает выделение О-цепи полисахаридов кислотным гидролизом при автоклавировании, осаждение полисахарида и липосахаридов спиртом, последовательное расщепление остатков липосахаридов, белков и нуклеиновых кислот ферментами (лизоцим, протеаза и нуклеаза), фракционирование фенолом и спиртом, ультрацентрифугирование, лиофилизацию и гель-фильтрацию на сефадексе. Выход составляет 500 мг из 100 г бактериальной массы. Срок изготовления 9 сут.

Недостатками данного способа являются его трудоемкость, сложность и длительность. Освобождение антигена от липосахаридов, белков и нуклеиновых кислот последовательным расщеплением ферментами длительный, сложный и трудоемкий процесс, требующий применения дорогостоящих препаратов. Кроме того, дальнейшая очистка антигена с помощью ультрацентрифугирования и гель-фильтрации на сефадексе требует применения дорогостоящего и громоздкого оборудования. Применение дорогостоящих препаратов и оборудования значительно повышает стоимость антигена.

В основу изобретения положена задача разработать способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных с такой очисткой от примесей, которая обеспечивала бы получение высокоочищенного антигена на простом, более дешевом оборудовании и с помощью недорогих препаратов.

Поставленная задача решается тем, что способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий выделение О-цепи полисахаридов бруцелл рода Brucella abortus кислотным гидролизом при автоклавировании с последующим осаждением их спиртом и освобождение антигена от липосахаридов, белков и нуклеиновых кислот, согласно изобретению освобождение антигена от липосахаридов, белков и нуклеиновых кислот проводят осаждением трихлоруксусной кислотой с последующей гель-фильтрацией в агарозе.

В предлагаемом способе освобождение антигена от липосахаридов, белков и нуклеиновых кислот проводят осаждением трихлоруксусной кислотой и окончательную очистку проводят гель-фильтрацией в агарозе, что позволяет сократить срок изготовления антигена до 4 сут по сравнению с известным решением. Кроме того, предлагаемый способ менее трудоемкий, чем в известном решении, не требует применения дорогостоящих препаратов и оборудования, что значительно снижает стоимость антигена. Антиген, полученный предлагаемым способом, имеет высокий выход 500 мг из 100 г сырой клеточной массы бруцелл и малое количество примесей около 2%

П р и м е р. 100 г сырой клеточной массы бруцелл рода Brucella abortus в S-форме ресуспендировали в 250 мл 2%-ной уксусной кислоты, содержащей 10% NaCl, и автоклавировали 30 мин при 121^оС. Суспензию охлаждали, центрифугировали 30 мин, 6000 об/мин, 4^оС. Осадок отбрасывали, супернатант нейтрализовали добавлением 0,5 М NaOH, охлаждали до 0^оС и добавляли 1,3 л охлажденного этанола, оставляли на ночь для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин, 10 мин, 4^оС, растворяли в 15 мл 20 мМ трис-HCl рН 7,0, содержащего 5% NaCl, и диализовали против стократного избытка того же буфера два раза в течение 12 ч. Разбавляли диализат в 17 мл того же буфера, нерастворимый осадок отделяли центрифугированием. Супернатант охлаждали во льду и добавляли 10 мл 2 М трихлоруксусной кислоты. Инкубировали 15 мин во льду, центрифугировали 15 мин, 1000 об/мин, 4^оС. Супернатант нейтрализовали добавлением 0,5 М NaOH и диализовали против 0,05 М веронал-мединалового буфера (веронал 1,38 г, мединал 8,76 г, ионная сила 0,05, рН 8,6) в течение ночи. Полученный раствор смешивали с равным объемом 1,6%-ной агарозы на том же буфере при 55^оС и заливали в хроматографическую колонку. Элюцию проводили 60 мл веронал-мединалового буфера. Элюент лиофилизировали. Получили 500 мг свободной О-цепи полисахаридов бруцелл. Количество белков и нуклеиновых кислот в антигене определяли по методу Лоури и спектрофотометрически. Препарат содержал 98% О-цепи полисахаридов бруцелл и около 2% примесей, представляющих собой остатки белка и нуклеиновых кислот.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенный антиген для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных простым и экономичным способом без применения дорогостоящих препаратов и оборудования и за более короткий срок.