профилактический биопрепарат субалин

Формула изобретения

Профилактический биопрепарат, включающий живую биомассу Bacillus Subtilis и наполнитель, отличающийся тем, что он содержит биомассу Bacillus Subtilis ВКПМ В-4759 при следующем соотношении компонентов, об.

Биомасса Bacillus Subtilis ВКПМ В-4759 (1 10⁹ 1 10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора) 92 98

Наполнитель 2 8

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития патогенных бактерий и вирусов.

В настоящее время имеются биопрепараты, подавляющие развитие патогенных бактерий лакто-; бифидум-; колибактерин, бификол, бактисубтил, бактерин-СЛ [1-4] Известны также штаммы бацилл, вызывающие синтез эндогенного интерферона [5] однако с невысоким титром продуцируемого интерферона. Однако неизвестны биопрепараты, эффективные при вирусных инфекциях.

Наиболее близким к изобретению является препарат бактерин-СЛ [4] В основе этого биопрепарата две культуры аэробных спорообразующих бактерий В.subtilis и B.licheniformis. Препарат характеризуется высокой эффективностью при дисбактериозах, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, однако не обладает выраженной антивирусной активностью.

Целью изобретения является создание биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностью, а также способностью индуцировать в организме синтез -интерферона.

Это достигается тем, что в качестве основы биопрепарата используют рекомбинантный штамм В.subtilis ВКПМ В-4759 (положительное решение по заявке N 4836055/13/063118 от 7.06.90), характеризующийся высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также антивирусной за счет продукции интерферона человека типа -2.

Рекомбинантный штамм, используемый в качестве основы биопрепарата, должен характеризоваться стабильностью введенной плазмидной ДНК при пассировании культуры через организм. Исследование стабильности плазмидной ДНК в штамме В. subtilis ВКПМ В-4759 проводили на белых мышах массой 18-20 г. В опыт отбирали животных, у которых в предварительных исследованиях не высевались из фекалий бактерий рода Bacillus. Животным вводили перорально по 1 дозе препарата. Через 18 ч проводили высев микрофлоры фекалий на МПА. Выросшие изолированные колонии В.subtilis перекалывали на МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр для подсчета количества клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду. Из культуры, выросшей на МПА, готовили суспензию в физиологическом растворе и вводили повторно животным перорально. Через 18 ч повторяли процедуру выделения В.subtilis и определения количества клонов, утративших плазмиду. Было проведено 10 пассажей культуры через организм.

Из случайно отобранных клонов, полученных после 10 пассажей через организм, выделяли плазмидную ДНК и анализировали с помощью эндонуклеаз рестрикции. Установлено, что плазмидная ДНК стабильно сохраняется и наследуется в течение 10 пассажей через организм животных.

Сохранность гена интерферона человека типа 2 в рекомбинантной плазмиде после пассажей через организм подтверждали методом гибридизации. Фильтры с отпечатками колоний после пассажей гибридизовали с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона типа 2, выделенным из плазмиды. Установлено, что все клоны, не потерявшие рекомбинантную плазмиду после пассажей через организм, гибридизировались с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона, что свидетельствовало о сохранности гена интерферона типа 2 в составе плазмиды.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки В.subtilis ВКПМ В-4759 и наполнитель, об.

Биомасса В.subtilis ВКПМ В-4759

1 ^.10⁹ 1 ^.10⁹ живых микробных клеток в 1 мл

физиологического раствора 92-98

Наполнитель 8-2

Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.

В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови, молоко и т. д. предпочтительно сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины).

Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (табл. 1).

Антивирусную активность препарата определяли по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Установлено, что препарат характеризуется антивирусной активностью в отношении ЕМС за счет синтеза интерферона типа 2, уровень которого составлял 2^. 10⁵ 5^. 10⁵ МЕ/л. Изучали также уровень содержания интерферона в организме мышей, получавших препарат. Для этого препарат вводили перорально мышам 1 раз в день в течение 3 дней из расчета 1 доза/кг веса. Уровень содержания и -интерферона в сыворотке крови мышей исследовали через 24 ч после одно-,двух- и трехразового введения препарата. За титр интерферона принимали величину, обратную разведению исследуемой сыворотки, вызывающему 50% защиты клеток диплоидных фибробластов мыши Л-929 от 100 ЦПД₅₀ тест-вируса ЕМС. Результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что при трехкратном пероральном введении препарата регистрируются максимальные уровни продукции как -, так и -интерферона. Такие уровни содержания интерферона в крови по данным литературы [5] обеспечивают выраженный антивирусный эффект.

Препарат характеризуется безвредностью для животных (табл.3,4).

П р и м е р. На основе штамма В.subtilis ВКПМ В-4759 с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены пять вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата. Вариант I.

Препарат, содержащий, об.

Биомасса В.subtilis ВКПМ

В-4759 0,5^. 10⁸ живых микроб-

ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 92

Наполнитель (сыворотка крови КРС) 8 Вариант II

Биомасса В.subtilis ВКПМ

В-4759 1^. 10⁹ живых микроб-

ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 94 Наполнитель (молоко) 6 Вариант III.

Биомасса В.subtilis ВКПМ

В-4759 5 ^.10⁹ живых микроб-

ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 95

Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатина) 5 Вариант IV.

Биомасса В.subtilis

ВКПМ В-4759 1 ^.10¹⁰ живых

микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 97 Наполнитель (сыворотка крови КРС) 3 Вариант V.

Биомасса В.subtilis ВКПМ

В-4759 5 ^.10¹⁰ живых микроб-

ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 98

Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 2

Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы, высушивали лиофильно, ампулы запаивали.

Проверяли безвредность полученных вариантов препарата для лабораторных животных, специфическую активность в отношении тест-культур представителей различных групп патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также продукцию интерферона типа 2.

Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 18-20 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37^оС в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37^оС по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N2 без исследуемой культуры.

Полученные данные результатов испытания вариантов препарата представлены в табл.5.

Оптимальные количества живых микробных клеток В.subtilis ВКПМ В-4759 в 1 мл физиологического раствора составляют 1^. 10⁹ 1^. 10¹⁰ клеток при их объемном содержании 92-98% Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмом.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата безвредны для животных, характеризуются антагонистической активностью в отношении тест-культур, а также способностью продуцировать интерферон типа -2. Поэтому предлагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются.