штамм бактерий bacillus thuringiensis var kurstaki для получения биоинсектицида

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Kurstaki ВКПМ В-5155 для получения биоинсектицида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый, не образующий спор штамм Bacillus thuringiensis (ВТ) III серотипа (НЗ) var. kurstaki 7A (ВКПМ-5155) для получения на его основе экологически безопасного, не содержащего живых спор энтомоцидного биопрепарата для борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями сельского хозяйства.

Выпускаемые в настоящее время энтомопатогенные препараты на основе Bac. thuringiensis содержат смесь сухих спор и кристаллов -эндотоксина. Хотя известно, что основным действующим началом является белковый инсектицидный -эндотоксин и наличие спор является не обязательным. Титр жизнеспособных спор в препаратах достигает 60-100 млрд/г. При применении таких препаратов белковые кристаллы разлагаются и через некоторое время исчезают, тогда как споры благодаря своей устойчивости продолжают длительное время существовать и в благоприятных условиях могут прорастать и размножаться.

В связи с этим перспективным является создание бесспоровых биоинсектицидов еще более экологически безопасных, чем существующие средства защиты растений (СЗР).

Известен штамм ВТ-Н3 Z-52 (аналог базовый) продуцент -эндотоксина (авт. св. СССР N 769787, 1984).

Однако недостатком шт. Z-52 является образование кроме -эндотоксина значительного количества спор, которые могут прорастать, размножаться и загрязнять окружающую среду.

Известен штамм ВТ-Н4 var. dendrolimus ИПМ-2а аспорогенный продуцент -эндотоксина (авт.св. СССР N 1367484, 1985).

Однако недостатком указанного штамма является более низкая энтомоцидная активность и меньший выход -эндотоксина, чем у предлагаемого штамма.

Известен штамм ВТ var/kurstaki ИПМ-13а аспорогенный мутант.

Однако недостатком указанного штамма также является более низкая инсектицидная активность.

Для достижения цели предлагается апорогенный штамм Bacillus thuringiensis var.kurstaki 7А. Штамм хранится в коллекции культур ВНИИ прикладной микробиологии и депонирован во Всесоюзной кол- лекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер ВКПМ N В-5155).

Штамм 7А получен из штамма Z-52 путем химического мутагенеза помощью этилметанульфоната и последующей селекции по признаку отсутствия спорообразовния.

Штамм 7А характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Аэроб. Грамположительный. Оптимум роста 29-32^оС. Вегетативные клетки крупные подвижные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Размер клеток (1,5-1,7) (3,6-6,2) мкм. В стационарной фазе развития продуцируются белковые кристаллические включения ромбовидной формы размером (0,6-0,8) (1,3-2,0) мкм, споры не образуются, так как споруляция блокирована на IV стадии.

Характер роста на различных питательных средах.

На мясо-пептонном агаре через 1 сут инкубации образуются округлые серовато-белые колонии диаметром 3-5 мм со слабоволнистым краем, матовой мелкозернистой поверхностью, пастообразной консистенцией. Через 3-5 сут колонии становятся серыми, гладкими, появляется прозрачная кайма по краю.

На сухом питательном агаре рост обильный, колонии округлые, кремовато-белые, матовые, мелкозернистые со слегка изрезанным краем, пастообразной консистенции.

На молочном агаре рост обильный, колонии белые, гладкие, матовые с зоной просветления до 18-20 мм.

На картофельном агаре рост обильный, колонии округлые, белые, гладкие со слегка изрезанным краем.

На ломтиках картофеля рост обильный, налет мелкозернистый, матовый, пигмент не образуется.

На мясо-пептонном бульоне образуется равномерная муть.

Желточная среда через 1 сут. инкубации образуются округлые серотова-белые колонии диаметром 2-6 мм со слабо волнистым краем, матовые, с зоной побеления среды вокруг колоний до 5 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода. Использует глюкозу, мальтозу, крахмал, целлобиозу, салицин, эскулин. Не утилизирует сахарозу маннозу, маннит, лактозу.

Отношение к источникам азота. Усваивает аммонийные формы азота. Восстанавливает нитраты. Молоко пентонизирует. Желатину разжижает. Мочевину разлагает.

Образует ацетилметилкарбинол и лецитиназу.

Антигенные свойства. Относится к III серотипу Bac.thuringiensis var.kurstaki (НЗа3в).

Патогенные свойства. Не продуцирует термостабильный экзотоксин. Патогенен для многих видов насекомых из рода чешуекрылых.

Не токсичен для теплокровных животных.

Отношение к фагам. Устойчив к фагам И-77. 11, 25/16. Чувствителен к фагам с/п, 17, 22. Собственных вирулентных фагов не выделяет.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Штамм 7А выращивают в течение 12-16 ч на скошенном МПА. Полученной культурой инокулируют ферментационную среду следующего состава, мас. дрожжи кормовые (БВК) 3,0, кукурузная мука 1,5, водопроводная вода остальное. рН среды после стерилизации 6,8-7,2. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с 30 мл питательной среды на круговой качалке со скоростью вращения 260 об/мин при 29-13^оС в течение 48 ч. Полученную КЖ прогревают при 70^оС в течение 20 мин и высевают по 0,1 мл на МПа. Визульано роста колоний штамма не наблюдают, что свидетельствует об отсутствии жизнеспособных спор в культуральной жидкости.

П р и м е р 1. 5 мл суспензии спор (10 спор/мл) штамма Z-52 в фосфатном буфере (0,1 М, рН 7,0) прогревают на водяной бане при 70^оС в течение 20 мин. После охлаждения суспензии до комнатной температуры добавляют 0,1 мл этилметансульфоната и инкубируют при 28^оС на круговой качалке в течение 15-18 ч. Затем смесь центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин при 5^оС. Осадок дважды отмывают физиологическим раствором и переносят в 2,5 мл фосфатного буфера. 100 мкл полученной суспензии высевают на чашки Петри с МПА и инкубируют при 30^оС в течение 2-3 сут. Выросшие колонии исследуют с помощью фазово-контрольной микроскопии и отбирают клоны без споруляции.

П р и м е р 2. Культуру штамма 7А выращивают на скошенном МПА при 30^оС в течение 12-18 ч и используют для засева 300 мл ферментационной среды в колбе объемом 2 л. Посевную культуру выращивают в колбе на качалке при 30^оС в течение 7 ч, проверяют отсутствие в ней фага и посторонней микрофлоры и используют для засева ферментера.

Ферментационная питательная среда имеет следующий состав, мас. дрожжи кормовые (БВК) 3, мука кукурузная 1,5, водопроводная вода остальное.

Ферментацию ведут до полного лизиса клеток и наличия в среде 50-70% свободных кристаллов, что контролируется фазово-контрастной микроскопией. Получают культуральную жидкость, содержащую кристаллы -эндотокcина, небольшую примесь нелизированных вегетативных клеток и остатки питательной среды. Инектицидная активность культуральной жидкости в отношении личинок непарного шелкопряда (в расчете на ЛК₅₀) составляет 0,022-0,066%

В приведенных ниже таблицах представлены свойства предлагаемого штамма и препаратов на его основе в сравнении прототипами.

В табл. 1 приведены сравнительные данные по инектицидной активности культуральной жидкости и продуктивноти предлагаемого шт. 7А, прототипов (шт. ИПМ-13а, шт. ИПМ-2а) и аналога (шт. Z-52).

Как следует из данных, приведенных в табл. 1, шт. 7А превосходит шт. ИПМ-13а, шт. ИПМ-2а и шт. Z-52 по инсектицидной активности соответственно в 1,88; 27,0 и 1,57 раз.

В табл. 2 представлены сравнительные данные по чувствительности к фагам штаммов.

Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что по фагоустойчивости шт. 7А, шт. ИПМ-13а и шт. ИПМ-2а находятся на одном уровне: все штаммы чувствительны к трем из шести фагов, выделенных в производстве средств защиты растений.

В табл. 3 представлены сравнительные данные по инсектицидной активности и содержанию -эндотоксина в образцах препаратов на основе предлагаемого штамма и штаммов-прототипов, полученных по регламенту производства лепидоцида концентрированного.

Из данных, представленных в табл. 3, следует, что инсектицидная активность образца препарата на основе предлагаемого шт. 7А, полученного по традиционной технологии, превосходит таковую препаратов на основе штаммов-прототипов.