способ получения изолированных клеток картофеля
Классы МПК: | C12N5/04 клетки или ткани растений C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них |
Автор(ы): | Желдакова Р.А., Шевчик В.Е., Евтушенков А.Н., Таманькова А.В., Фомичев Ю.К. |
Патентообладатель(и): | Белорусский государственный университет |
Приоритеты: |
подача заявки:
1991-07-04 публикация патента:
10.04.1995 |
Использование: биотехнология, клеточная инженерия. Сущность изобретения: изолированные клетки картофеля получают путем обработки листовой ткани ацетатным буфером и мацерирующей смесью, в которую в качестве пектолитического ферментного препарата вводят микробиологически синтезируемую мацеразу С, а в качестве целлолитического - целловиридин ГЗх. 1 табл.
Рисунок 1
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ, включающий обработку листовой ткани в натрий-ацетатном буфере и последующую обработку в мацерирующей смеси, содержащей пектолитические и целлюлолитические ферментные препараты, отличающийся тем, что в качестве пектолитического ферментного препарата используют препарат мацераза С, продуцируемый бактериями Erwinia chrysanthemi ENA 49-5, обладающий пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностью, а в качестве целлюлолитического препарата используют целловиридин ГЗх.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, биохимии, генетической и клеточной инженерии, физиологии растений, в частности к способам получения отдельных клеток растений. Известен способ получения клеток из ткани листьев табака [1] при использовании ферментного препарата пектиназа-500 в комплексе с ферментом Onozuka R-10 (Serva, ФРГ). Этим методом можно получить до 6 106 клеток из грамма сырых листьев. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ обработки пересадочной культуры растительной ткани для проведения цитометрического контроля и получения протопластов [3]Способ заключается в поэтапной обработке растительной биомассы ферментным препаратом Bacillus macerans, обладающим пектат-транс-элиминазной активностью и целлюлазой в течение 4-10 ч при 20-30оС и 2-4 ч при 22-26оС при аэрировании и постоянном перемешивании. Целью изобретения является упрощение и удешевление способа получения изолированных клеток растений картофеля. Цель достигается тем, что предлагается использовать комплексный ферментный препарат пектолитического действия (мацераза С), продуцируемый бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5 [2] обладающий пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностями, совместно с целловиридином ГЗх отечественного производства, обработку обоими препаратами проводить в одну стадию, без перемешивания. Выделение изолированных клеток достигается также и тем, что проводится последовательная обработка листовой ткани картофеля в натрий-ацетатном буфере (рН 4,7-4,9) и далее в солевом растворе, содержащем пектолитические и целлюлолитические ферменты без перемешивания при комнатной (18-24оС) температуре и освещенности 2 103 лк в течение 16 ч. Микроскопический анализ показывает, что в течение 3-4 сут до 60% образующихся клеток сохраняют жизнеспособность и способность к делению. П р и м е р 1. Фиксированное по весу количество листьев картофеля, нарезанных на полоски шириной 3-5 мм, вносят первоначально в 0,025 М натрий-ацетатный буфер (рН 4,7-4,9) и выдерживают при комнатной (18-24о) температуре 1 ч. После промывания в 0,01 М Трис-HCl буфере, рН 8,0, листовую ткань помещают в солевой раствор следующего состава, мг/л: сахароза 171000, KH2PO4 27,2; KNO3 101,0; MgSO4 7H2O 246,0; KJ 0,16; CuSO4 5H2O 0,025; CaCl2 1480,0; рН 5,8, содержащий 0,03 мг/л мацеразы С и 10000 мг/л целловиридина ГЗх. После 16 ч инкубирования при комнатной (18-24о) температуре и освещенности 2 103 лк, проводят подсчет образующихся клеток в камере Горяева. Эффективность выделения клеток для двух сортов картофеля приведена в таблице. Данный способ обладает следующими преимуществами:
а) возможность исключения импортных ферментных препаратов, которые могут быть заменены отечественными;
б) упрощением способа получения за счет совместного использования целлюлолитических и пектолитических ферментов, возможностью проведения процесса при комнатной температуре без перемешивания;
в) возможностью получения однородной суспензии, состоящей из жизнеспособных клеток.
Класс C12N5/04 клетки или ткани растений
Класс C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них