фрагмент днк ltf, предназначенный для выявления гена термолабильного энтеротоксина энтеробактерий

Формула изобретения

ФРАГМЕНТ ДНК LTF, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНА ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, кодирующий часть аминокислотной последовательности А-субъединицы термолабильного энтеротоксина и полную аминокислотную последовательность В-субъединицы термолабильного энтеротоксина, выделенный из ДНК Shigella flexneri, с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании изобретения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения токсигенных энтеробактерий, содержащих ген LT-токсина, методом молекулярной гибридизации.

Известны рекомбинантные плазмиды, используемые для создания продуцентов LT-токсина, необходимого для получения вакцин и сывороток против диарейных заболеваний человека и животных.

Однако ДНК-зонды на термолабильный токсин, аналогичные LTf-фрагменту, в литературе не описаны.

Для получения LTf-фрагмента выделяют методом Birnboim и Dolly тотальную плазмидную ДНК штамма Shigella flexneri серовариант 6 N 218 (штамм из коллекции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии со следующей нуклеотидной последовательностью:

10 20 30 40 50 60

5" AAGCTTGG AG AGAAGAACCC TGGATTCATC ATGCACCACA AGGTTGTGGA AATTCATCAA

70 80 90 100 110 120

GAACAATTAC AGGTGATACT TGTAATGAGG AGGCCCAGAA TCTAGACACA ATATATCTCA

130 140 150 160 170 180

GGGAATATCA ATCAAAAGTT AAGAGGCAGA TATTTTCAGA CTATCATGCA GAGGTTGACA

190 200 210 220 230 240

TATATAACAG AATTCGGGAT GAATTATGAA TAAAGTAAAA TTTTATGTTT TATTTACGGC

250 260 270 280 290 300

GTTACTATCC TCTCTATGTG CACACGGAGC TCCTCAGTCT ATTACAGAAC TATGTTCGGA

310 320 330 340 350 360

ATATCACAAC ACACAAATAT ATACGATAAA TGACAAGATA CTATCATATA CGGAATCGAT

370 380 390 400 410 420

GGCAGGCAAA AGAGAAATGG TTATCATTAC ATTTAAGAGC GGCGCAACAT TTCAGGTCGA

430 440 450 460 470 480

AGTCCCGGGC AGTCAACATA TAGACTCCCA AAAAAAAGCC ATTGAAAGGA TGAAGGACAC

490 500 510 520 530 540

ATTAAGAATC ACATATCTGA CCGAGACCAA AATTGATAAA TTATGTGTAT GGAATAATAA

550 560 570 580 590 600

AACCCCCAAT TCAATTGCGG CAATCAGTAT GGAAAACTAG TTTGCTTTAA AAGCATGTCT

610 620 630 640 650 660

AATGCTAGGA ACCTATATAA CAACTACTGT ACTTATACTA ATGAGCCTTA TGCTGCATTT

670 680 690 700 710 720

GAAAAGGCGG TAGAGGATGC AATACCGATC CTTAAACTGT AACACTATAA CAGCTTCCAC

730 740 750 760 770

TACAGGGAGC TGTTATAGCA AACAGAAAAA ACTAAGCTAG GCTGGGGGGG CAAGCTT 3"

Плазмидную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Hind III, полученные фрагменты разделяют электрофорезом в 0,9%-ном агарозном геле, в качестве маркеров молекулярного веса используют фрагменты ДНК фага -продукты Hind III гидролиза. Фрагмент плазмидной ДНК с размером около 800 пар нуклеотидов (п. н.) извлекают из геля методом электроэлюции и очищают методом фенольной депротеинизации.

П р и м е р 1. 1.1 Конструирование плазмиды pNN 1 - источника получения фрагмента LTf.

Синтез ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона pGEM4Z (pGEM4Z - коммерческий вектор фирмы Promega, США).

1 мкг ДНК вектора pGEM4Z гидролизуют рестриктазой Hind III (1 ед. акт.) в течение 1 ч при 37^оС в буфере VII следующего состава: 0,01 М трис рН 8,0; 0,006 М MgCl₂; 0,006 M меркаптоэтанол; 0,4 М NaCl. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (1/10 части) реакционной смеси в 0,8% -ном агарозном геле.

1 мкг суммарной плазмидной ДНК Sh. flexneri сероварианта 6 гидролизуют рестриктазой Hind III (1 ед. акт.) в течение 1 ч при 37^оС в буфере VII.

Плазмидную ДНК (1 мкг) и суммарную плазмидную ДНК Sh. flexneri сероварианта 6 (3 мкг) лигируют в 30 мкл буфера (0,66 мМ трис-HCl pH 7,6; 50 мМ MgCl₂; 10 мМ АТФ; 50 мМ дитиотреитола; ДНК-лигаза 3-10 ед. активности) в течение 15-18 ч при 12-14^оС. Реакцию лигирования контролируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле.

Лигазной смесью трансформируют штамм E. coli TG 1. Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии плазмиды pGeM4Z он способен синтезировать фермент -галактозидазы за счет комплементации дефектного хромосомного гена N-концевым фрагментом гена, находящегося на плазмиде. Эта способность штамма не проявляется в присутствии рекомбинантных плазмид со встроенным по Hind III сайту фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, из-за сдвига рамки считывания -галактозидазы. Клоны с такими рекомбинантными плазмидами, не обладающие -галактозидазной активностью, отбирают на индикаторной среде с хромогенным субстратом Xgal по отсутствию голубой окраски.

После трансформации E. coli TG 1 лигазной смесью культуру высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 200 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл Xgal и 240 мкг/мл индуктора -галактозидазы-ИПТГ. Через 14-20 ч на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.

1.2. Отбор и анализ рекомбинантных клонов со специфическими последовательностями В-субъединицы термолабильного энтеротоксина.

Поиск клонов, несущих рекомбинантную плазмиду со специфическим Hind III фрагментом, содержащим 189 пар нуклеотидов А-субъединицы и 588 пар оснований В-субъединицы термолабильного энтеротоксина, осуществляют методом рестрикционного анализа и последующим определением нуклеотидных последовательностей проклонированных фрагментов. Для этого белые колонии трансформантов пересевают на чашки с МПА, содержащим 200 мкг/мл ампициллина в 5 мл МПБ с такой же концентрацией ампициллина. Чашки и пробирки культивируют при 37^оС в течение 18 ч. Затем из культуры, выросшей в жидкой среде, выделяют плазмидную ДНК щелочным методом и проводят ее гидролиз рестриктазой Hind III в буфере VII в течение 1 ч при 37^оС. Полученные гидролизаты изучают электрофоретически в 0,8%-ном агарозном геле. Для дальнейшей работы отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду со вставкой размером 750-800 пар оснований. Нуклеотидную последовательность вставок определяют методом Сэнгера. Секвенирование Hind III фрагмента и сравнение полученной нуклеотидной последовательности с банком данных пакета "Microgenie" (Beckman) позволяют выявить вставки, содержащие 189 пар оснований А-субъединицы и 589 пар оснований В-субъединицы термолабильного энтеротоксина.

П р и м е р 2. Использование LTf-фрагмента в качестве зонда для выявления ДНК гена LT-токсина.

2.1. Получение радиоактивного зонда для выявления токсигенных штаммов энтеробактерий.

Выделяют рекомбинантную плазмиду pNN 1 из 100 мл 18-20-часовой культуры методом Birnboim и Doly. Для выделения зонда 10 мкг плазмидной ДНК гидролизуют в объеме 100 мкл рестриктазой Hind III (20-40 ед. акт.) в буфере VII в течение 1 ч при 37^оС. Полноту гидролиза проверяют электрофорезом аликвоты 0,2 мкг рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. Затем оставшуюся рестрикционную смесь разделяют электрофоретически в 0,8%-ном агарозном геле. Извлечение из агарозного геля нужного фрагмента ДНК проводят электроэлюзией как описано в Руководстве Маниатиса с соавт. - М.: Мир, 1984.

Мечение зонда изотопом Р-32 и гибридизацию проводят по руководству Маниатиса с соавт.

2.2. Выявление гена LT-токсина с помощью LTf-фрагмента в клетках энтеробактерий разных видов.

В связи с тем, что в стране не имеется коммерческих тест-систем для выявления токсигенных бактерий, основанных на ИФА- или ДНК-зондах, результаты, полученные при гибридизации с созданным ДНК-зондом на термолабильный токсин, сравнивают с результатами, полученными при выявлении токсигенных бактерий методом Пастернака М.А., Андрусенко И.Т., Ведьминой Е.А., 1985 г. Данный метод не может рассматриваться как альтернатива методам, основанным на использовании ДНК-зондов или иммунодиагностикумов, поскольку он позволяет лишь косвенно судить о наличии гена термолабильного энтеротоксина по способности исследуемых токсигенных штаммов подавлять дегидрогеназную активность УФ-мутанта штамма S. aureus p209, может быть применен только для изучения чистых культур, довольно трудоемок и не позволяет исследовать большое количество образцов.

LTf-фрагмент апробирован при изучении распространения гена термолабильного энтеротоксина в обширной коллекции штаммов энтеробактерий различных по видовой принадлежности и происхождению. Исследовано 829 штаммов.

18-часовые культуры исследуемых микроорганизмов в объеме 100 мкл вносят в лунки плашки репликатора и штампом делают реплики на нитроцеллюлозные фильтры, предварительно помещенные в чашки Петри на поверхность 2%-ного мясопептонного агара. Чашки с фильтрами инкубируют при 37^оС в течение 16-18 ч. После этого фильтры денатурируют, нейтрализуют, отжигают и гибридизуют как описано в руководстве Маниатиса с соавт.

Результаты исследования энтеробактерий разных видов на наличие гена LT-токсина приведены в таблице.

С помощью LTf-фрагмента ген термолабильного энтеротоксина выявляется у разных видов энтеробактерий, результаты согласуются с данными, полученными при использовании биологического теста и с данными эпидемиологических исследований. Ген LT-токсина чаще выявляется у штаммов, выделенных от больных, у энтеробактерий, относящихся к патогенным видам, и реже у штаммов, выделенных из объектов внешней среды и у условно-патогенных энтеробактерий.

2.3. Апробация LTf-фрагмента на пищевых продуктах.

Для изучения возможности использования LTf-фрагмента для индикации токсигенных энтеробактерий в продуктах питания проведены эксперименты по искусственной контаминации проб различных продуктов (колбасы, мясного фарша, мясной тушенки, молока, воды) заведомо токсигенными штаммами Escherichia coli HB101, Klebsiella pneumoniae 842, Salmonella typhimurium 1433, дававшими положительную реакцию на токсигенность по методу Пастернака И.А. и др., и в гибридизации с LTf-фрагментом.

При постановке экспериментов использованы методические указания по исследованию продуктов питания МЗ СССР, Главного управления ветеринарии при государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и в объектах внешней среды" (Москва, ВО "Агропромиздат, 1990).

5 г каждого продукта гомогенизируют в 50 мл физиологического раствора и разводят 1:20.

Культуры E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium выращивают в пробирке со скошенным 2% -ным мясопептонным агаром в течение 18-24 ч при 37^оС и смывают физиологическим раствором.

К 9 мл суспензии, полученной от каждого продукта, прибавляют по 1 мл взвеси бактериальной культуры в следующих концентрациях 10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ кл/мл. Количество бактериальных клеток во взвеси определяют визуально по оптическому стандарту мутности (ОСМ).

Одновременно высевают по 0,1 мл взвеси контаминированного продукта каждой концентрации на чашки с 2%-ным мясопептонным агаром в двух повторностях для определения общего числа живых микробных клеток. Чашки инкубируют 18-24 ч при 37^оС и подсчитывают количество колоний, выросших на агаре.

Исследуемые образцы вносят в лунки плашки репликатора и при помощи штампа делают реплики на нитроцеллюлозные фильтры, находящиеся на поверхности 2% -ного мясопептонного агара в чашке Петри, чашки с фильтрами инкубируют при 37^оС в течение 18-24 ч. После этого фильтры денатурируют, нейтрализуют, отжигают и гибридизуют как описано в руководстве Маниатис с соавт. Положительную реакцию в гибридизации c LTf-фрагментом дали все исследуемые пробы, содержавшие 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10 микробных тел. Следовательно, метод позволяет выявлять единичные клетки энтеротоксигенных бактерий в 1 г продукта.

2.4. Применение LTf-фрагмента в качестве зонда при обследования объектов пищевой промышленности.

При обследовании птицефабрики, предприятий птицеперерабатывающей промышленности, торговли и общественного питания были взяты следующие пробы: смывы с тушек кур, с оборудования на различных этапах технологического процесса обработки птицы, со спец одежды сотрудников и других санитарно-показательных объектов, а также пробы корма птиц. Всего исследовано 120 проб, в 57 из них результаты гибридизации показали наличие токсигенных микроорганизмов. Параллельно был проведен бактериальный анализ этих проб. При этом были выделены штаммы сальмонелл различных серовариантов, у которых при дальнейшей проверке в реакции гибридизации с LTf-фрагментом выявлен ген термолабильного токсина.

Результаты исследований показывают, что данный фрагмент может быть использован для санитарно-микробиологического обследования различных объектов внешней среды. Поскольку LTf-фрагмент позволяет исследовать одновременно большое количество проб на наличие токсигенных энтеробактерий без предварительного выделения чистой культуры микроорганизмов, он может быть рекомендован для скрининговых исследований в санитарной микробиологии.

Изобретение может использоваться для совершенствования схемы индикации токсигенных энтеробактерий.