спермагглютинирующее средство растительного происхождения

Формула изобретения

СПЕРМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, отличающееся тем, что оно представляет собой лектин из семян Datura innoxia семейства Solanaceae.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине, оно может быть использовано как для изучения агглютинирующих свойств лектинов, так и в медицинской практике при разработке новых контрацептивных средств. Предлагаемое изобретение касается тех лектинов, которые обладают спермагглютинирующим действием. Известны лектины с таким спектром действия из других растительных источников [1]. Лектины-спермагглютинины являются мощным потенциалом при создании новых противозачаточных средств наружного воздействия. В целом лектинам не присуща спермагглютинирующая активность, она отмечается у отдельных представителей этого класса белков.

Так, в работе [1] изучены лектины растений Индии, специфичных к сперматозоидам. Исследованы 114 видов растений, относящихся к 46 семействам, главным образом к семейству Fabaceаe. Большинство представленных источников относится к редко встречающимся растениям и не может быть промышленным источником лектинов.

Близким аналогом также может служить лектин из семян хлебного дерева (Artocarpus heterophуllus). Лектин обладает N-ацетилглюкозамин углеводной специфичностью и также агглютинирует сперматозоиды человека.

В данном случае из семян Datura innoхia выделен лектинный препарат, состоящий из двух лектинов с одинаковой углеводной специфичностью. Поскольку указанные семена не содержат других лектинов и оба лектина обладают аналогичным действием, предложен метод выделения суммы лектинов. Полученный препарат содержит два гомогенных лектина. При выделении лектинов из семян Datura innoхia были использованы классические методы выделения белков, применяемые в биохимии. Данные о том, что семена Datura innoхia содержат лектины гемагглютинины были известны ранее [2]. Однако свойство агглютинировать сперматозоиды человека для лектинов из семян Datura innoхia открыто впервые. Следует отметить, что семена Datura innoхia (семенные Solanaceaе) являются перспективным и доступным источником лектинов, поскольку это растение культивируется специально в Чимкентской области Казахстана для получения из семян лекарственных препаратов. Шрот семян после экстракции изопропиловым спиртом на производстве является также отличным источником лектинов.

Суммарный препарат лектинов из семян Datura innoхia содержит два лектина: с молекулярной массой (I) 130 кДа и (II) 260 кДа (I 70%, II 30%). Лектины отличаются по аминокислотному составу и изоэлектрической точке, имеют одинаковую углеводную специфичность. Содержание суммы лектинов составляет 0,5 вес. % семян. Оба вида лектинов обладают описанным свойством и могут быть использованы как отдельно, так и вместе.

Способ получения лектинов, является стандартным. Поскольку в описанном случае могут использоваться либо отдельно два гомогенных лектина, либо смесь двух гомогенных лектинов, способ получения не влияет на свойства получаемых веществ.

Так как способность лектинов из Datura innoхia взаимодействовать с рецепторами сперматозоидов открыта впервые, то это открывает перспективы широкого использования последних в биологии при изучении топографии и структуры рецепторов сперматозоидов человека и животных, а также при создании новых видов контрацептивных средств и при изучении механизма контрацепции на основе специфической агглютинации сперматозоидов.

Изучение спермагглютинирующей активностии.

1. Получение сперматозоидов.

Эякулят получали от здоровых доноров (N 10). Инкубировали 30 мин при комнатной температуре для разжижения, после чего исключали наличие антиспермальных антител, как описано ниже. Фракцию подвижных сперматозоидов получали методом "Svim up". Для этого на поверхности образца спермы (после разжижения) аккуратно наслаивали 8 мл среды М 199 и инкубировали при температуре 37^oC в токе СО₂ в течение 90 мин. При этом подвижные сперматозоиды переходят в верхний слой. После инкубации верхний слой аккуратно отбирали микропипеткой и использовали для дальнейших исследований.

2. МАР - тест (miхеd Agglutination Reaction).

МАР - тест использовали для определения антиспермальных антител в сперме донора. Для проведения МАР - теста смешивали на слайде 10 мкл спермы, 10 мкл латексных шариков, покрытых антигенами человека и 10 мкл анти-сыворотки кролика (Орто Диагностик, Бельгия). Результаты реакции исследовали с помощью фазово-контрастного микроскопа при увеличении 400, учитывали количество сцепленных с шариками подвижных сперматозоидов (МАР, %) по отношению к 100 подвижным сперматозоидам в пробе. Результаты регистрировали через 2-3 мин после приготовления пробы и повторно через 10 мин. Результат МАР-теста считаетcя положительным, если 10% или более подвижных сперматозоидов в пробе несут на себе шарики. Во всех дальнейших экспериментах использовали только МАР-негативные образцы.

3. Определение жизнеспособности сперматозоидов.

При определении жизнеспособности клеток использовали окрашивание клеток ИП, проникающее и накапливающееся в мертвых клетках. К суспензии клеток добавляли ИП (конечная концентрация 20 мкг/мкл) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Поскольку интенсивность флуоресценции связанного ИП значительно выше, чем свободного, отмывание не проводили. С помощью флуоресцентного микроскопа оценивали количество мертвых и живых клеток, подсчитывая в каждом образце не менее 200 сперматозоидов.

4. Определение агглютинирующей активности.

Навеску лектинного препарата разводили в среде 199 непосредственно перед началом экспериментов и добавляли к суспензии сперматозоидов в ячейке 96 луночных микротестов в различных концентрациях. Агглютинацию оценивали немедленно после добавления и после 4 ч инкубации при 37^oC в СО₂ ингибиторе. Для этого использовали фазово-контрастный микроскоп фирмы LЕIТZ. Оценивали количество свободных активно подвижных сперматозоидов и характер агглютинатов в каждом образце. Следует отметить, что для проявления спермагглютинирующей активности не имело значения от какого донора (человека) взята сперма. Аналогичное действие проявлялось и на сперме различных животных.

Изучение спермагглютинирующей активности вещества "Хоуп" проводили с использованием фракции отмытых от семенной жидкости активно подвижных сперматозоидов, а также с использованием цельной спермы. Суспензию активно подвижных сперматозоидов помещали в ячейке 96-луночного микротеста с различными разведениями вещества "Хоуп" в среде 199. В первых трех экспериментах использовали следующие концентрации: 10 мг/мл, 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл. Во всех экспериментах наблюдалась мгновенная агглютинация сперматозоидов при добавлении вещества "Хоуп" в концентрации 1 мкг/мл и выше. В дальнейшем проводили изучение агглютинирующего действия в интервале концентраций вещества "Хоуп" от 100 до 0,1 мкг/мл. Наблюдали зависимость характера агглютинации от концентрации вещества "Хоуп". При концентрации от 10 до 2,5 мкг/мл наблюдали агглютинация в виде тяжей и нитей сцепленных между собой сперматозоидов, причем отмечались взаимодействие как голова-голова, хвост-голова и голова-хвост. Наблюдали также адгезию части клеток на пластик. В этом интервале концентраций наблюдалась 100%-ная агглютинация сперматозоидов. Отдельные подвижные сперматозоиды отсутствовали. Начиная с концентрации 1 мкг/мл характер агглютинации менялся: наблюдались сферические агглютинаты, а также подвижные сперматозоиды. При снижении концентрации вещества "Хоуп" до 0,5 мкг/мл количество свободных сперматозоидов резко возрастало. Подобная концентрационная зависимость наблюдалась в пяти экспериментах.

При инкубации сперматозоидов с веществом "Хоуп" в течение 4 ч при 37^oC в СО₂ инкубаторе наблюдалась обратимость агглютинации при концентрациях ниже 10 мкг/мл - количество агглютинатов уменьшалось и появлялось много одиночных активно подвижных сперматозоидов. При концентрации 10 мкг/мл наблюдались отдельные подвижные сперматозоиды, при концентрациях 20 мкг/мл и выше единичных сперматозоидов не обнаруживалось.

При использовании цельной спермы 100%-ная необратимая агглютинация наблюдалась при дозе вещества "Хоуп" 50 мкг/мл и выше.

С помощью флуоресцентного зонда иодида пропидия было проведено изучение цитотоксического действия вещества "Хоуп" на сперматозоиды. На чертеже приведена дозовая зависимость жизнеспособности сперматозоидов после четырех часов инкубации с различными концентрациями вещества "Хоуп" ("Х"). За 100% принята жизнеспособность сперматозоидов в среде 199. Как следует из чертежа, обнаружена очень незначительная цитотоксическая активность вещества при концентрациях от 500 до 1 мкг/мл. Испытание спермагглютинирующей активности лектинов из "Datura innохia" на различных донорах проводилось в Институте охраны здоровья матери и ребенка Минздрава России (г. Москва).