способ получения конъюгата катехоламинов

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ путем конденсации N-защищенного катехоламина с носителем с последующим снятием защиты, отличающийся тем, что, с целью расширения спектра носителей, защиту катехоламина проводят -трет-бутоксикарбонилом, конденсируют его с E-аминокапроновой кислотой и ковалентно связывают продукт с носителем методом получения активированных жиров.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунохимии, в частности способам присоединения катехоламинов к молекуле носителя, и может быть использовано в медицине для разработки методов определения антител к катехоламинам и самого гаптена в крови и тканях человека и животных в целях диагностики, а также в научных целях.

Известен способ получения конъюгатов катехоламин-белок с помощью глутарового альдегида или карбодимида. При использовании их в качестве иммуногенов получены антисыворотки с низким средством и специфичностью. Они не позволяют различать катехоламины, имеющие различную структуру алифатической цепи.

Известен способ получения конъюгатов катехоламинов с белком в реакции конденсации с помощью формальдегида по Маниху с предварительной защитой алифатической NH₂-группы. Недостатком способа является получение антисыворотки с низкой специфичностью и перекpестными реакциями 10-45% с родственными катехоламинами при использовании для иммунизации конъюгатов адреналин-бычий сывороточный альбумин (А-БСА). В качестве прототипа выбран способ связывания молекулы катехоламина с белком в реакции аминометилирования. Способ включает защиту NH₂-группы катехоламина янтарным ангидридом. Связывание гаптена с альбумином проводят в соотношении 0,3М и 0,2-0,5М соответственно. Использованные для иммунизации конъюгаты имели молярное число 16-20. С помощью полученной антисыворотки (в рабочем разведении 2 ^.10⁴) в тест-системе на базе твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) определены концентрации стандарта адреналина, равные 10⁸-10² пкг/мл пробы. Перекрестные реакции другими веществами катехоловой структуры составили 0-0,01%.

К недостаткам способа следует отнести: для снятия защиты молекулы адреналина требуется инкубация конъюгата в течение суток при 60^оС и рН 1, использование формальдегида в реакции связывания адреналина с белком. Обе процедуры вызывают деструкцию белков и ограничивают выбор белка-носителя для катехоламинов группой альбуминов.

Целью изобретения является расширение спектра носителей.

Поставленная цель достигается способом получения конъюгатов катехоламинов (КА), в которых защиту NH₂-группы КА проводят карбалкоксикарбонильными группами, а инкубацию сложного эфира гаптена с белком ведут в боpатном буфере при рН 8,2 при комнатной температуре в течение 1 сут. Снятие защиты проводят инкубируя продукт с трифторуксусной кислотой 30 минут при комнатной температуре.

Сущность способа состоит в конденсации N-защищенной молекулы КА с Е - аминокарбоновой кислотой в реакции Маниха, и присоединении N-оксисукцинимидного эфира полученного продукта к белку в боратном буфере при рН 8,5 при инкубации 1 сут и комнатной температуре.

Первоначально введенная по NH₂-группе КА третбутоксикарбонильная группа снимается обработкой трифторуксусной кислотой при комнатной температуре 15-30 мин. Конъюгат диализуется и высушивается лиофильно. Полярное число составило для белков 24 и 25, для полилизина-53. Воспроизводимость получения конечного продукта составляет 100%.

Отличительными признаками способа по изобретению являются:

использование для защиты аминогруппы КА алкоксикарбонильной группы с последующим снятием ее в мягких условиях, конденсация N-замещенного КА с Е-аминокарбоновой кислотой и присоединением белка в 0,1 М боратном буфере при рН 8,5 и комнатной температуре в атмосфере азота.

Способ осуществляется следующим образом.

К суспензии адреналина (или норадреналина) в растворителе добавляют дитретбутилпирокарбонат, смесь перемешивают в течение 2 ч. К полученному твердому остатку добавляют Е-аминокапроновую кислоту. Затем прибавляют формальдегид и метиловый спирт. Колбу, заполненную азотом, инкубируют 3-е сут. Из реакционной смеси продукт выделяют хроматографией на колонке IH-20. Выделенный продукт растворяют в диметилформамиде (ДМФА), смешивают с дициклогексилкарбодиимидом, гидроксисукцинимидом и оставляют на 18 ч при 20^оС. Растворитель удаляют на вакууме. 0,05 мМ продукта адреналина, растворенного в 50 мкл ДМФА, инкубируют с 0,1 М боратным буфером, содержащим 25 мкг белка в атмосфере азота. Молярное отношение продукт-белок равно 100:1. После инкубации 1 сут конъюгат диализуют в 0,01М растворе уксусной кислоты. После лиофильного высушивания снимают защиту NH₂-группы с помощью ТФУК, диализуют и высушивают лиофильно.

П р и м е р 1. К суспензии адреналина (1 г) в 10 мл ДМФА добавляют 1,25 г дитрет-бутил пирокарбоната в ДМФА. Смесь перемешивают в течение 2 ч при 30^оС до завершения реакции. Растворитель удаляют в вакууме. Твердый остаток растворяют в эфире, раствор промывают водой, 0,4 М раствором КНSO₄ и насыщенным раствором NaCl. Эфирный слой сушат при помощи сульфита натрия, а растворитель отгоняют над вакуумом. Выход N-трет-бут-оксикарбонил адреналина (1) равен 1,02 г. В Н⁺-ЯМР-спектре в Д₃ОД содержатся характерные полосы при d 1,4(с) [C(CH₃] при 2,80 (с) [NCH₃] и мультиплет при 6,68-6,80 (фенильные Н).

В 2 мл 3 М раствора ацетатного буфера с рН 6,0 растворяют 126 мг продукта 1, добавляют 2 мл раствора 0,3М бикарбоната натрия, содержащего 157,4 мг -аминокапроновой кислоты. Затем прибавляют 3 мл 7,5% формалина и 3 мл метилового спирта. Колбу заполняют азотом и оставляют на 3-е сут до завершения реакции. Продукт 11 выделяют из реакционной смеси хроматографией на колонке с насадкой LH-20 после элюции смесью хлороформметанол (1:2) в средней фракции. Тонкослойная хроматография на пластине силикагеля, элюент пиридин-бутанол-вода-уксусная кислота (10:15:12:3). Исходные продукты I и Е - аминокапроновая кислота (Е-АКК) имеют R_f 3,4 и 1,6 соответственно. В Н¹ - ЯМР спектре в СД₃ОД содержатся характерные поломы при g 1,42(c) [C(CH₃)₃], 3.66 (c) [NCH₃], 4,69m (CH-OH), 3,36 g (-CH₂-N), 6.68-6.92m (H₂; H₃(CH₂), 2,35m (CH₂COO-) 40 мг продукта 11 растворяют в ДМФА, добавляют 22,3 мг дициклогексилкарбодиимида, 12,4 мг N-гидроксисукцинимида, оставляют на 18 час при 20^оС, осадок отделяют фильтрованием и получают раствор, содержащий 5- (N^I -сукцинимидилокси-карбонил-Е-пептиламинометил)-N-БРК адреналин. Растворитель удаляют на вакууме, продукт (III) сохраняют на холоду в Н¹ - ЯМР-спектре в СDCl₃ содержится характерная полоса при gmg:1,42 с C(CH₃)₃], 2.79c) - - , 3.32g/ -CH₂-N 4,67m (CH-OH). Из сухого остатка берут навеску, соответствующую 0,05 мМ адреналина (продукт III), содержащего 0,05 мМ гаптена, помещают в 4,5 мл 0,1М боратного буфера с рН 8,2, содержащего 25 мг БСА (5^.10^-4 мМ). Молярное соотношение продукт/белок равен 100:1. Колбу заполняют азотом и инкубируют 24 ч, после чего диализуют в 0,005-0,01М растворе уксусной кислоты 1 сут. Продукт лиофильно высушивают и растворяют в 2-х мл ТФУК и оставляют при комнатной температуре 20-30 мин, диализуют в 0,005М растворе уксусной кислоты и сушат лиофильно. Сухой продукт является ковалентным конъюгатом адреналина и БСА. Молярное число равно 25.

П р и м е р 2. Как описано в примере 1, в качестве белка-носителя используется соевый ингибитор трипсина (10 мг СИТа и 140 мг продукта адреналина (III), получают ковалентный конъюгат с молярным числом 24.

П р и м е р 3. В качестве носителя используют синтетическую полиаминокислоту полилизин. Как описано в примере 1, соотношение продукта адреналина (III) и полилизина равно 100:1 (140 мг продукта III и 1 мг полилизина). Молярное число составило 50.

П р и м е р 4. Кривые разведения и калибровочные кривые для определения концентраций стандарта адреналина. Определение разведения антисыворотки и конъюгатов для построения калибровочных кривых проводили с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) на полистироловых планшетах для иммунологических реакций Московского завода. Использовали высокоспецифические антисыворотки к адреналину (4). Конъюгаты, полученные в примере 1 и 2, с использованием в качестве носителей кроличий сывороточный альбумин (КСА), соевый ингибитор трипсина (СИТ), служили антигеном, сорбированным на полистироле.

Кривые разведения антисыворотки к адреналину. С помощью кривых разведения определяли оптимальное соотношение концентрации сорбированного антигена и разведения антисыворотки. В интервале 1 - 20 мкг/мл пробы (см. фиг.1) и наблюдали линейное изменение оптической плотности (ОД) и снижение ее при 100 мкг/мл пробы. Максимальная ОД выявлена для разведения антисыворотки 1/200. На фиг. 2 видна линейная зависимость ОД от разделения тестируемой антисыворотки при различной концентрации сорбированного антигена, что отражает достоверность измеряемого показателя, т.е. содержание антител или количество иммобилизованного антигена. Оптимальная концентрация антисыворотки равна 1/200 и антигена - 5 мкг/мл. Построение калибровочных кривых проводили с помощью гетерогенного ИФА в варианте количественной нейтрализации с иммуноферментной меткой против глобулинов кролика. В качестве антигена использовали также конъюгат КСА-адреналин, полученный описанным ранее способом (4). Чувствительность измерения адреналина в обоих случаях близка и составила 1 нг/мл. Перекрестных реакций с норадреналином и дофамином не обнаружено (фиг.3). Таким образом, полученные описанным способом конъюгаты с использованием любого из показанных нами выше носителей могут быть применены как иммуногены для иммуноферментного анализа.