способ иммунокоррекции при гнойном перитоните

Формула изобретения

СПОСОБ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ПРИ ГНОЙНОМ ПЕРИТОНИТЕ, включающий введение сыворотки больным перитонитом, отличающийся тем, что аутосыворотку смешивают в равной пропорции с суспензией зимозана, содержащей в 0,2 мл 1 мг препарата, инкубируют в течение 30 мин при 37⁰С, после чего центрифугируют и надосадочную жидкость вводят внутрикожно по 0,2 мл в 2-3 точки 3 раза в день в течение 7-10 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии и иммунологии, и может быть использовано в качестве иммунокоррегирующего средства в комплексном лечении гнойного перитонита.

Известен способ иммунокоррекции при некоторых хронических воспалительных заболеваниях с помощью интактной аутологической сыворотки крови больных. Однако этот способ обладает умеренной терапевтической эффективностью, что вероятно связано с недостаточной иммунотропной активностью применяемой сыворотки. В связи с этим поиск путей усиления иммунотропных свойств аутологичной сыворотки крови больных может обеспечить достаточную эффективность этого способа иммунокоррекции и расширить показания для его применения, в том числе и при гнойном перитоните, одной из причин неблагоприятных исходов которого является низкая иммунологическая реактивность организма.

Известен способ лечения сывороткой крови больных, выздоравливающих от перитонита.

Целью изобретения является разработка эффективного способа иммунокоррекции при гнойном перитоните аутологичной сывороткой крови больных за счет усиления ее иммунотропной активности и повышения иммунологической реактивности организма посредством ее внутрикожного введения. Способ осуществляется следующим образом.

Экспериментальная часть.

Эксперименты проводили на мышах линии (CBA x C57B/6)F. У животных получали в стерильных условиях кровь из ретроорбитального синуса и из пула крови выделяли сыворотку, которую разделяли на три равные порции. Первую часть сыворотки оставляли интактной, во второй инактивировали комплемент путем ее термообработки в водяной бане при 56^оС в течение 45 мин. В третьей порции сыворотки активировали комплемент путем ее обработки зимозаном. Для этого к 50 мг зимозана (sigma) добавляли 2 мл дистиллированной воды и кипятили на водяной бане в течение 30 мин. Затем зимозан отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя 3 раза в режиме 200g 5 мин. Полученный осадок зимозана суспензировали в 10 мл физиологического раствора и по 0,2 мл суспензии зимозана вносили в чистые стерильные центрифужные пробирки. Эти пробирки с суспензией зимозана центрифугировали в режиме 200g 5 мин и к осадку зимозана добавляли 0,2 мл мышиной сыворотки. После ресуспензирования пробирки инкубировали в течение 30 мин при 37^оС. Затем их центрифугировали при 400g в течение 20 мин и собирали надосадочную жидкость, содержащую сыворотку с активированной системой комплемента. Последнее было подтверждено в тесте хемотаксиса нейтрофилов в агарозном методе.

У мышей линии (CBA x C57B/6)F массой тела 18-20 г индуцировали экспериментальный перитонит путем внутрибрюшинного введения по 0,5 мл взвеси смешанной суточной культуры E. coli штамм 0111 К58 Н11 С130-53 и B. fragilis штамм 373. Затем животные были разделены на четыре группы. Мышам первой группы вводили внутрикожно по 0,1 мл физиологического раствора. Животные второй группы получали внутрикожно сингенную интактную сыворотку. В третьей группе мышам вводили внутрикожно по 0,1 мл инактивированной прогреванием сингенной сыворотки. Мыши четвертой группы получали по 0,1 мл активированной зимозаном сингенной сыворотки. Всем животным препараты начинали вводить через 3 ч после индукции перитонита 3 раза в день через 8 ч в течение 7 дней. На 1, 3, 7, 10 сут путем декапитации выводили из эксперимента по 5 животных из каждой группы и после их вскрытия сердце, печень, почки, легкие, тонкий кишечник, брюшину подвергали гистологическому исследованию.

Об эффективности иммунокоррекции предлагаемым способом судили по морфологическому составу клеток перитонеального экссудата (ПЭ) животных, по состоянию иммунологической реактивности в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с клетками селезенки, а также по патоморфологическому состоянию ряда органов мышей, изученному с помощью гистологических методов.

П р и м е р 1. Под наблюдением находились животные 1-й группы, которым вводили в кожу хвоста стерильный физиологический раствор. В клеточном составе ПЭ через 1, 3, 7 и 10 сут после индукции перитонита было соответственно 81 + 3,2%; 74,4 + 2,7%; 71,8 + 4,2% и 51,3 + 2,7% полиморфно-ядерных лейкоцитов; 9 + 0,9%; 10,3 + 1,6%; 5,9 + 0,9% и 8,6 + 1,7% лимфоцитов; 10,2 + 1,3%; 16,0 + 2,0%; 24 + 2,1% и 41 + 5,2% макрофагов. По данным РТМЛ иммунологическая реактивность организма была значительно снижена. Индекс ингибиции миграции (ИИМ) лейкоцитов был 0,97 + 0,07; 0,85 + 0,08; 0,74+ + 0,05; и 0,76 + 0,08 соответственно через 1, 3, 7 и 10 сут после индукции перитонита. В то время как у интактных животных он колебался в пределах 0,52 + 0,09. У обследуемых животных во все сроки наблюдения при гистологическом исследовании внутренних органов отмечались выраженные патологические изменения, которые с помощью полуколичественного анализа оценивались на +++.

П р и м е р 2. Наблюдались животные 2-й группы, которым в качестве иммунокорректора вводили внутрикожно аутологичную интактную сыворотку. При лабораторном анализе получены следующие данные. В клеточном составе ПЭ через 1, 3, 7 и 10 сут после индукции перитонита было соответственно 72 + 3,1% ; 61,5 + 3,0%; 58 + 2,7% и 48,1 + 1,9% полиморфно-ядерных лейкоцитов; 12,1 + 1,2% ; 15,3 + 0,9%; 14,2 + 1,7% и 11 + 0,8% лимфоцитов; 16 + 1,9%; 24,8 + 2,0% ; 28 + 1,7% и 41,6 + 3,9% макрофагов. В РТМЛ ИИМ был 0,83 + 0,08; 0,75 + 0,06; 0,73 + 0,05 и 0,65 + 0,04 соответственно через 1, 3, 7 и 10 сут после начала лечения. При гистологическом исследовании внутренних органов отмечались патологические изменения, которые оценивались с помощью полуколичественного анализа на ++.

П р и м е р 3. Обследованы животные 3-й группы, которым в качестве иммунокорректора вводили аутологичную сыворотку с инактивированным комплементом. При лабораторном анализе в клеточном составе ПЭ этих мышей через 1, 3, 7 и 10 сут было соответственно 80,3 + 5,6%; 69,1 + 2,9%; 68,5 + 2,4% и 61,0 + 4,8% полиморфно-ядерных лейкоцитов; 11,0 + 0,7%; 8,9 + 0,6%; 10,7 + 0,6% и 12,9 + 1,1% лимфоцитов; 9,1 + 0,9%; 23,1 + 1,5%; 22,0 + 1,2% и 27,6 + 1,7% макрофагов. Индекс ингибиции миграции лейкоцитов в РТМЛ был 0,81 + 0,07% ; 0,75 + 0,08; 0,65 + 0,09 и 0,63 + 0,06 соответственно на 1, 3, 7 и 10 сут после начала лечения. У животных данной группы при гистологическом исследовании внутренних органов отмечались такие же выраженные патологические изменения, как и в 1-й группе, и с помощью полуколичественного анализа оценивались на +++.

П р и м е р 4. Под наблюдением находились мыши 4-й группы с экспериментальным перитонитом, леченные предлагаемым способом иммунокоррекции с помощью сингенной сыворотки, активированной зимозаном. В процессе проводимого лечения в ПЭ этих животных было 65,7 + 3,6%; 51,6 + 2,9%; 50,0 + 2,2% и 53,2 + 1,9% полиморфно-ядерных лейкоцитов; 20,5 + 1,0%; 22,9 + 0,8%; 15,7 + 0,9% и 18,6 + 1,5% лимфоцитов; 15,9 + 0,7%; 27,5 + 0,8%; 35,7 + 1,3% и 37,3 + 2,3% макрофагов соответственно через 1, 3, 7 и 10 сут после начала лечения. В эти сроки наблюдения ИИМ в РТМЛ был соответственно 0,75 + 0,08; 0,64 + 0,05; 0,60 + 0,07 и 0,78 + 0,09. Патологические изменения внутренних органов у животных этой группы были незначительными и оценивались на +.

Следовательно, по полученным экспериментальным данным, включающим оценку патологических изменений внутренних органов, клеточный состав перитонеального экссудата и состояния иммунологической реактивности в РТМЛ выявлено, что предлагаемый способ иммунокоррекции перитонита с помощью сингенной сыворотки крови, активированной зимозаном, и последующего ее внутрикожного введения является наиболее эффективным по сравнению с терапевтическим эффектом интактной сингенной сыворотки и сингенной сыворотки с инактивированным комплементом.

Клиническая часть.

Из периферической крови больных перитонитом получали сыворотку. Затем в ней активировали комплемент с помощью зимозана. Для этого к 50 мг зимозана (Sigma) добавляли 2 мл дистиллированной воды и кипятили на водяной бане в течение 30 мин. В последующем зимозан отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя 3 раза в режиме 200g 5 мин. Полученный осадок зимозана суспендировали в 10 мл физиологического раствора и по 0,2 мл (1 мг) суспензии зимозана вносили в стерильные центрифужные пробирки. Пробирки центрифугировали в режиме 200g 5 мин, надосадочную жидкость удаляли и к осадку зимозана добавляли 0,2 мл сыворотки больного. После ресуспензирования пробирки инкубировали при 37^оС в течение 30 мин. За это время в сыворотке активировался комплемент, что подтверждалось в агарозном тесте усилением хемотаксиса нейтрофилов под влиянием активизированной сыворотки по сравнению с интактной сывороткой. После инкубации пробирки центрифугировали в режиме 400g в течение 20 мин и собранную аутологичную сыворотку вводили внутрикожно больным по 0,2 мл в 2-3 точки в область предплечья. Такие инъекции активированной аутологичной сыворотки делали больным три раза в сутки через 8 ч в течение 7-10 дней после операции. При этом следует отметить, что каждый раз для активации зимозаном использовали сыворотку, приготовленную перед лечением и хранившуюся при - 20^оС.

Эффективность предлагаемой иммунокоррекции в комплексной терапии перитонита оценивали в динамике по количеству и функции клеток иммунной системы больных. В крови определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Количество Т- и B-лимфоцитов определяли реакциями розеткообразования с эритроцитами барана и мыши. Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов в ответ на митоген и реакцией торможения миграции лейкоцитов. Реакцию спонтанной миграции нейтрофилов и НСТ-тест использовали для оценки функции нейтрофилов. О функциональной активности моноцитов судили по количеству клеток, экспрессирующих HLA-DR-антигены в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

П р и м е р 1. Больной Г., 80 лет. Диагноз: острый гангренозный перфоративный аппендицит. Распространенный гнойный перитонит, токсическая стадия. Операция: лапаротомия, аппендэктомия, дренирование брюшной полости.

До операции в общем анализе крови регистрировалось: СОЭ 22 мм/ч; лейк. - 7,9 х x10/л; лейкоцитарная формула: нейтрофилы (Н) - 76%, палочкоядерные лейкоциты (ПЛ) - 16%, эозинофилы (Э) - 1%, лимфоциты (Л) - 3%, моноциты (М) - 4% . Данные иммунологического исследования крови: Т-лимфоциты "общие" - 31%; Т-лимфоциты "активные" - 24%; B-лимфоциты - 8%. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) на ФГА - 48%. Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) на ФГА: индекс миграции (ИМ) = 0,82. Реакция спонтанной миграции нейтрофилов (РСМН) ИМ = 2,3; НСТ-тест нейтрофилов - 51%. Количество моноцитов, несущих HLA-DR-антигены - 13%.

Больной К. , 75 лет. Диагноз: острая спаечная кишечная непроходимость. Гангрена тонкой кишки. Распространенный гнойный перитонит, токсическая стадия. Операция: лапаротомия, разделение спаек, резекция 1 м тонкой кишки, энтеро-энтероанастомоз, дренирование брюшной полости.

До операции в общем анализе крови регистрировалось: СОЭ 29 мм/ч; лейк. - 11,8 х 10/л; лейкоцитарная формула: Н - 78%, ПЛ - 12%, Л - 7%, М - 2%. Данные иммунологического обследования крови: Т-лимфоциты "общие" - 23; Т-лимфоциты "активные" - 18%; B-лимфоциты - 7%; РБТЛ - 46%; РТМЛ - ИМ = 0,86; РСМН - ИМ = 2,1; НСТ-тест - 56%; количество моноцитов, несущих HLA-DR-антигены - 9%.

Приведенные лабораторные данные больного Г. и больного К. свидетельствуют об умеренно выраженном СОЭ, лейкоцитозе, сдвиге лейкоцитарной формулы влево, а также указывают на нарушение иммунологической реактивности организма, которое проявлялось недостаточностью Т-звена иммунитета, снижением количеств моноцитов, экспрессирующих HLA-DR-антигены, и изменение функциональной активности нейтрофилов.

Больным Г. и К. в комплексное лечение гнойного перитонита было включено иммунокоррегирующее лечение с помощью предлагаемого изобретения, которое выполнялось по приведенной схеме. В результате проведенного лечения были получены следующие лабораторные данные, которые представлены в табл.1.

У больных Г. и К. в результате проведенного комплексного лечения, включающего иммунокоррекцию активированной зимозаном аутологичной сыворотки, наступила положительная лабораторная динамика. В периферической крови нормализовалось общее количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула. Отмечалось повышение иммунологической реактивности организма, что проявлялось повышением количества Т-лимфоцитов "общих", снижением числа Т-лимфоцитов "активных", восстановлением функциональной активности этих клеток и нормализацией со стороны функциональной организации нейтрофилов и моноцитов крови. Клинически это проявлялось в улучшении общего состояния, нормализации на 3 сут после операции температуры тела, уменьшении признаков эндогенной интоксикации. Послеоперационный период протекал гладко. Раны зажили первичным натяжением. Больные Г. и К. выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии через 17 и 19 дней после операции.

П р и м е р 2. Больной М., 62 года. Диагноз: острый гангренозный перфоративный аппендицит. Распространенный гнойный перитонит, токсическая стадия.

Операция: лапаротомия, аппендэктомия, дренирование брюшной полости.

До операции в общем анализе крови определялось: СОЭ 24 мм/ч; лейк. - 9,5 х 10⁹/л; лейкоцитарная формула: Н - 74%, ПЛ - 2%, Л - 21%, М - 3%. Данные иммунологического обследования крови: Т-лимфоциты "общие" - 27%; Т-лимфоциты "активные" - 19%; B-лимфоциты - 8%, РБТЛ - 43%; РМТЛ - ИМ = 0,91; РСМН - ИМ = 1,89; НСТ-тест - 65%. Количество М-экспрессирующих HLA-DR-антигены - 12% . Приведенные лабораторные данные больного М. показывают на ускоренное СОЭ, умеренно выраженный лейкоцитоз и изменения в иммунологическом статусе. Последнее проявлялось уменьшением количества Т-лимфоцитов и снижением их функции, а также изменением функциональной активности нейтрофилов и моноцитов.

В комплекс лечебных мероприятий (экстренная операция по устранению источника перитонита, лаваж брюшной полости 0,02%-ным раствором хлоргексидина биглюконата и 3%-ным раствором перекиси водорода в соотношении 10:1, назоинтестинальная интубация и лаваж кишечника энтеродезом, дренирование брюшной полости, комбинированная антибактериальная терапия, гепаринотерапия, контрикал, инфузионная терапия) больному М. не была включена иммунокорригирующая терапия с помощью предлагаемого изобретения.

В процессе лечения больного М. в динамике были получены следующие лабораторные данные (табл.2).

Следовательно, у больного М. в результате проведенного лечебного комплекса, не включающего иммунокоррекцию изобретением, не наступало эффективного повышения иммунологической реактивности организма. Сохранялся дефицит Т-звена иммунитета, не увеличивалось количество HLA-DR-позитивных моноцитов и не полностью восстанавливалась функциональная активность нейтрофилов по сравнению с данными, полученными у больных Г. и К., у которых в комплексное лечение была включена иммунокорригирующая терапия аутологичной сывороткой, активированной зимозаном.

Послеоперационный период у больного М. протекал тяжело. Температура тела нормализовалась только на 12 сут после операции. Послеоперационный период осложнился правосторонней нижнедолевой пневмонией, нагноением послеоперационной раны. В стационаре больным М. проведено 27 койко-дней.

Таким образом, приведенные клинические примеры показывают, что включение в комплексное лечение больных перитонитом предлагаемого способа иммунокоррекции позволяет эффективно повысить иммунологическую реактивность организма и достичь более полного выздоровления больных.

Преимуществом предлагаемого способа является:

впервые в качестве иммунокоррегирующего средства при перитоните применена аутологичная сыворотка крови больных;

впервые предлагается для повышения иммунотропных свойств аутологичной сыворотки крови больных перитонитом и иммунологической реактивности организма обрабатывать сыворотку зимозаном, после чего ее вводить больным внутрикожно;

предлагаемый способ иммунокоррекции в комплексе с другими способами лечения позволяет достичь более эффективного выздоровления больных перитонитом.