штамм вируса гриппа a(h2n3)гкв 2237 птиц для моделирования инфекции гриппа

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа А (Н2 N3) птиц ГКВ N 2237 для моделирования инфекции гриппа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А птиц (А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78), вызывающий у мышей манифестную инфекцию, регистрируемую по вирусологическим и серологическим показателям.

Предлагаемый штамм пригоден для определения протективных свойств вирусов гриппа А, изолированных не только от людей, но и от птиц. Возможно его использование для экологических наблюдений над вирусами гриппа А, предусматривающих моделирование экспериментальной гриппозной инфекции.

Вирусы гриппа А вызывают заболевания не только у человека, но и у многих видов домашних и диких птиц, свиней, лошадей, крупного рогатого скота, китов и других млекопитающих. Согласно зооантропонозной теории происхождения пандемических штаммов вируса гриппа А, они могут возникать в результате генетической реассортации в природе и последующей реинтродукции вируса в человеческую популяцию. Это указывает на важность и необходимость наблюдений за экологическими процессами и выявления штаммов вируса гриппа А животных и птиц, обладающих наибольшей потенциальной возможностью внедриться в человеческую популяцию.

Следует также учитывать, что универсальная антигриппозная вакцина должна содержать не только дрейф-варианты вирусов, циркулировавших среди людей ранее (Н1N1, H2N2, H3N2), но и детерминанты известных вирусов гриппа животных и птиц и возможные будущие антигенные детерминанты (В.М. Жданов, Эволюция вирусов, М., 1990).

Заявляемый штамм целесообразно использовать для решения научных задач, в частности: изучение генетических основ преодоления межвидового барьера (адаптация) для вирусов, циркулирующих среди разных хозяев.

До момента внедрения научных результатов в практику необходимо проведение опытов на лабораторных моделях, позволяющих отработать критерии для вакцинных штаммов, изучить протективные свойства. Для этих целей необходимы чувствительные к гриппозной инфекции экспериментальные лабораторные модели и вирусы гриппа, способные размножаться в организме восприимчивого хозяина. Широкое практическое использование мышей, их низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более редких и дорогих животных, например хорьков, обезьян. Поражения легких мышей, вызываемые заявляемым вирусом гриппа, представляют собой вирусную пневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную пневмонию у человека. Следует отметить, что в естественных условиях мыши резистентны к инфицированию вирусами гриппа.

В настоящее время известны штаммы вируса гриппа А, вызывающие летальную пневмонию у мышей - A/WSN/33/ (H1N1), A/PR/8/ 34(H1N1), A/CCCP/90/27(H1N1), A/Aichi/2/68(H3N2). Наиболее известным является штамм A/Aichi/2/68, прошедший более 100 пассажей через легкие мышей и обладающий высокой пневмовирулентностью.

Необходимо отметить, что до настоящего времени не имелось вирусов гриппа А птиц, адаптированных к размножению в легких мышей. Это в значительной степени обусловлено трудностями адаптации, так как вирусы гриппа птиц размножаются при 41 С, в том время как у млекопитающих температура тела на несколько градусов ниже. Вирулентные для мышей штаммы используются как для решения задач практического здравоохранения (определение протективных свойств при отборе кандидатов в вакцинные штаммы), так и в научных исследованиях.

Указанные аналоги представляют собой штаммы вируса гриппа А с гемагглютинином подтипа Н1 или Н3. Заявляемый штамм А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 (H2N3) сходен с вышеперечисленными аналогами по существу, но представляет собой новый в антигенном отношении вариант. Штамм относится к вирусам гриппа А с гемагглютинином подтипа Н2. К преимуществам данного штамма, несомненно относится его расширенные возможности, которые позволяют изучать протективные свойства вирусов гриппа, изолированных не только от птиц, но и людей.

Цель изобретения - получение вирулентного для мышей штамма вируса гриппа, пригодного для моделирования экспериментальной инфекции.

История получения штамма. Штамм получен в результате 22 последовательных пассажей через легкие белых мышей массой 6-8 г при интраназальном заражении. При первичном инфицировании в качестве исходного материала использовали неразведенную аллантоисную жидкость, в дальнейших пассажах - 10% суспензию легких белых мышей, забитых через 48 ч после заражения.

Предлагаемый штамм обладает всеми признаками и характеристиками вируса гриппа А и хранится в коллекции лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР (кодовый номер - ГКВ 2237). Штамм характеризуется следующими морфологическими, биологическими и антигенными свойствами:

1. Морфологические признаки. При негативном контрастировании в популяции содержатся вирионы гриппа стандартной сферической формы со средним диаметром 80-120 мм (81,2%). Имеются также филаментозны формы (5,4%), каплеобразные формы (10,9%), гигантские сферы (2,5%). При исследовании 200 частиц в популяции адаптированного к мышам штамма А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 (Н2N3) по сравнению с исходным отмечено увеличение филаментозных и каплеобразных форм с 3,5% до 16,3% , определяются также гигантские формы 2,5% (табл. 1).

2. Биологические свойства. Исходный вариант не размножался в легких белых мышей. Однако в ходе пассирования происходит селекция мутантов, приобретших способность размножаться в организме другого хозяина (мыши), при этом наблюдается изменение инфекционной активности, гемагглютинирующих свойств. Инфекционная активность адаптированного штамма - 7,3 lg ЭИД/0,2 мл.

3. Антигенные свойства. По антигенной композиции гемагглютинина (определяемой в РТГА с поликлональными крысиными сыворотками) адаптированный штамм не отличается от исходного (табл. 2). Отмечены различия в способности связываться с моноклональными антителами к гемагглютинину Н2 N 18, N 185, N 289, N 342. Вирулентный для мышей штамм А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 менее интенсивно взаимодействовал с моноклональными антителами к М-белку, наибольшие различия установлены для 3 антигенного сайта (табл. 3).

4. Иммуногенные свойства. Предлагаемый штамм обладает способностью более активно вырабатывать антитела у мышей (гомологичный титр 1:160) по сравнению с исходным авирулентным для мышей штаммом вируса гриппа (1:20).

5. Патогенность для мышей. Адаптированный вирус вызывает выраженные патологические изменения в легких, а также гибель мышей в течение 10 сут наблюдения. 50% гибели животных отмечено при инграназальном введении 50 мкл вируса в разведении 10^3,1, т.е. lg ЛД 50=3,1. Вирулентность адаптированного к мышам штамма равна 2,6.

6. Физико-химические свойства. При исследовании электрофоретической подвижности белков в ПАГе отмечены минорные вариации для НА и NР-белков у адаптированного штамма по сравнению с исходным.

Заявляемый штамм предлагается использовать для изучения протективных свойств штаммов вируса гриппа А с гемагглютинином подтипа Н2 как человеческого, так и животного происхождения. После иммунизации мышей инактивированными препаратами вируса интраназально вводят адаптированный штамм А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 и определяют уровень защиты.

Таким образом, предлагаемый штамм А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 сходен по способу получения с другими вирулентными для мышей штаммами, однако обладает важной особенностью - он относится к другому антигенному подтипу гемагглютинина (Н2) и изолирован от птиц. Использование предлагаемого штамма позволит изучать перекрестные протективные свойства вирусов, относящихся к Н2 подтипу гемагглютинина, и изолированных не только от птиц, но и от людей. Адаптированный к мышам штамм A/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 наряду с вирусами гриппа А с гемагглютинином Н1 и Н3 может быть использован для экологических наблюдений над вирусами гриппа А и моделирования гриппозной инфекции.

П р и м е р. Моделирование экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Для оценки протективных свойств различных штаммов вирусов гриппа А с гемагглютинином подтипа Н2, изолированных от человека и птиц, был использован заявляемый адаптированный к мышам штамм вируса гриппа А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 (H2N3).

Мышей F(DWR) массой 6-8 г (в каждой группе по 25 шт.) иммунизировали инактивированными -пропиолактоном (0,015 М конечная концентрация) препаратами вирусов гриппа А (Н2). В работе использовали следующие штаммы: А/Япония/1/57 (Н2N1), А/Ленинград/678/59 (H2N2), А/Ленинград/1468/65 (H2N2), А/утка/Марсель/46/76 (H2N3), А/утка/Нью-Джерси/1580/78 (H2N3), А/утка/Потсдам/80 (H2N3), А/чайка-хохотун/Нью-Джерси/75/85 (Н2N9). Для каждого препарата определяли дозу = 20 мкг белка/мышь, гемагглютинирующую и инфекционную активности (до обработки -пропиолактоном). Через 21 день после предварительного определения титра антител в сыворотках животных каждой группы под легким эфирным наркозом мышам интраназально вводили по 50 мкл патогенного для них штамма вируса гриппа А/Япония/1/57 в дозе 3 LD. Гибель мышей регистрировали в течение 10 дней после заражения, затем высчитывали % выживаемости животных. В контрольной группе животных (получавших плацебо- р-р БСА на физиологическом растворе) гибель животных составляла 100%. В остальных группах эти показатели колебались от 4% до 48,0%.

Сравнительный анализ полученных данных о степени защиты экспериментальных животных, получавших препараты различных вирусов гриппа А (Н2), позволяет судить о перекрестных протективных свойствах вирусов. Суммарный анализ этих результатов, а также данных об антигенной специфичности поверхностных белков, позволит судить о возможности внедрения в человеческую популяцию вирусов гриппа А (Н2) птиц, продолжающих изолироваться и в современных условиях.