способ выращивания растений в гидропонных системах непроточного типа

Формула изобретения

1. СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ В ГИДРОПОННЫХ СИСТЕМАХ НЕПРОТОЧНОГО ТИПА в циркулирующем питательном растворе, отличающийся тем, что, с целью предотвращения заражения растений возбудителями заболеваний, в процессе выращивания растений в питательный раствор вводят биомассу бактерий-антагонистов возбудителей заболеваний.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из бактерий-антагонистов используют штаммы бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-330 Д, или Pseudomonas chloraraphis ВКМ CR-331Д, или Pseudomonas fluorescenm ВКМ CR-329 Д, или Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-328Д, или Pseudomonas aurcofaciens ВКПМ В-4117.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при выращивании растений в гидропонных системах непроточного типа.

Известен способ выращивания растений в гидропонной системе непроточного типа, предусматривающий культивацию растений в циркулирующем питательном растворе [1].

Недостатком известного способа является возможность легкого перезаражения культивируемых растений через питательный раствор в случае попадания в систему фитопатогенов, поражающих выращиваемую культуру. Это делает практически невозможным использование данного известного способа для реального производства многих культур, поражаемых сосудистыми и корневыми фитопатогенами, исключает возможность выращивания элитного посадочного материала, основным требованием к которому является отсутствие фитопатогенов.

Целью изобретения является предотвращение заражения растений фитопатогенами.

Это достигается тем, что в способе выращивания растений в гидропонных системах непроточного типа отличительной особенностью является то, что в питательный раствор в течение всего периода выращивания растений периодически вводят клетки бактерий-антагонистов, преимущественно клетки новых штаммов: Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-330Д или Pseudomonas chlororaphis ВКМ CR-331Д или Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-329Д, или Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-328Д, или Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-4117.

Новые штаммы характеризуются следующими свойствами.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-330Д выделен из чернозема под некосимой залежью в Каменной степи Воронежской обл.

Это грамотрицательные, подвижные короткие палочки с полярными жгутиками, спор не образует. Размер 0,6 х 1,5 - 2,0 мкм. Клетки хорошо растут на многих стандартных питательных средах.

Морфология колоний на агаризованных средах (при 28^оС на 3-5 день): на МПА колонии гладки, беловатые, часто имеют слабый розовый оттенок, выпуклые, слизистой консистенции, диаметр 5-8 мм; на МПА с 2% глицерина наблюдается диссоциация на три колониальных типа:

1, Серые или желтовато-серые, слабо выпуклые, маслянистой консистенции;

2. Слизистые, выпуклые с розовым оттенком, крупные;

3. Розовые, более плотные и мелкие.

Пигмент на МПА желтовато-зеленый, диффундирующий в среду.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флуоресцирующих псевдомонад:

Кинг А - пигмент отсутствует;

Кинг Б - зеленый, флуоресцирующий интенсивный пигмент.

Физиолого-биохимические свойства: строгий аэроб, метаболизм глюкозы окислительный.

В факторах роста не нуждается. Разжижает желатин, пептонизирует молоко. Редуцирует нитраты до нитритов.

Образует леван из сахарозы.

Максимальная температура роста на питательных средах равна 35^оС, минимальная 4^оС, оптимальная 28^оС.

Хорошо растет при рН 5,0-8,0.

В качестве единственного источника углерода усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, сахарозу, глицерин и не усваивает рамнозу, галактозу, рафинозу, мальтозу, сорбит, маннит, дульцит, инозит, инулин.

Из источников азота лучше использует нитратную форму, чем аммонийную.

Штамм устойчив к антибиотикам: ампициллину (200 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), хлорамфениколу (200 мкг/мл) и чувствителен к стpептомицину (100 мкг/мл), канамицину (100 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен, не вирулентен для лабораторных животных.

Штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно-сухом состоянии (в ампулах) не менее 1 года.

Штамм Pseudomonas chlororaphis ВКМ CR331Д был выделен из ризосферы пшеницы, выращиваемой на дерново-подзолистой почве Московской области, в 1976 г.

Штамм характеризуется следующими признаками. Это неспорообразующие, грамотрицательные. подвижные палочки с полярными жгутиками, размер 0,6-0,7 х 1,2-1,5 мкм. Морфологию колоний определяли после 4-5 сут. роста при 28^оС.

На мясопептонном агаре (МПА) колонии круглые, гладкие, желтовато-белые, слабо выпуклые. На средах с 2% глицерина штамм диссоциирует на два колониальных типа, различающихся пигментацией: 1. Колонии образуют только зеленый пигмент;

2. Колонии образуют и зеленый, и красноватый пигмент.

На среде Кинга Б штамм образует интенсивный зеленый флуоресцирующий пигмент и игольчатые кристаллы.

На МПА-косяках штрих серый, полупрозрачный, плоский; пигмент зеленый, иногда на 3 сут. краснеет, при росте на мясопептонном бульоне вызывает сильное помутнение, образует осадок; на 1-3 сут. образует зеленый флуоресцирующий пигмент.

Физиолого-биохимические свойства: строгий аэроб, метаболизм глюкозы окислительный. Не нуждается в факторах роста. Обладает оксидазной и каталазной активностью. Редуцирует нитраты до газообразного азота. Аргининдигидролаза имеется. Разжижает желатин и пептонизирует молоко (активность протеолитических ферментов зависит от диссоцианта). Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Индол и сероводород не образует. Леван из сахарозы образует слабо. Реакция на метил-рот отрицательная. Растет при рН среды от 0,5 до 8,0 и при температуре от 4 до 37^оС, оптимальная температура 28^оС.

В качестве единственного источника углерода использует с образованием кислоты: арабинозу, галактозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, мелибиозу, трегалозу, маннит, сорбит, глицерин. Не усваивает ксилозу, рамнозу, сорбозу, мальтозу, лактозу, инулин, адонит, дульцит.

Хорошо усваивает соли молочной, янтарной, лимонной, масляной, аконитовой, пировиноградной, яблочной, малоновой, фумаровой кислот. Слабо усваивает муравьиную, уксусную, винную и не усваивает щавелевую, гликоконовую и бензойную кислоты.

Ис источников азота хорошо утилизирует нитратный и аммонийный азот, гликокол, аланин, аспарагин; слабо - тирозин и пептон.

Штамм устойчив к следующим антибиотикам: хлорамфениколу (200 мкг/мл), не устойчив к стpептомицину (100 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг мкг/мл) и канамицину (30-100 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен, не вирулентен для лабораторных животных. Хранится штамм на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, и в лиофильно сухом состоянии (в ампулах) не менее года. Для получения лиофилизированного препарата клеток штамма его выращивали на агаризованном бульоне Хоттингера и клетки смывали средами, обычно применяемыми для лиофилизации.

Штамм Pseudomobas fluorescens ВКМ CR-329Д выделен из соснового опада на черноземе Каменной степи Воронежской обл. Он характеризуется следующими признаками.

Это неспорообразующие, грамотрицательные короткие подвижные палочки с пучком полярных жгутиков. Штамм хорошо растет на богатых питательных средах и на минимальных средах с глюкозой, глицерином.

Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут. роста при 28^оС.

На МПА колонии беловатые, выпуклые или кратерообразные, иногда с морщинистым центром, довольно крупные, до 10 мм в диаметре, образуют много слизи. Пигмент зеленый, флуоресцирующий (в УФ-свете), диффундирует в среду.

На МПА с 2% глицерина колонии беловатые, слизистые, выпуклые или кратерообразные. Пигментация на средах Кинга: Кинг А - отсутствует, Кинг В - интенсивная зеленая.

МПА-косяки: рост хороший, беловатый, иногда с сиреневым оттенком, слизистый; пигмент зеленый, флуоресцирующий. Наблюдается образование кристаллов.

Физиолого-биохимические свойства.

Строгий аэроб, использует глюкозу только по окислительному пути. В факторах роста не нуждается. Образует аргининдигидролазу, каталазу, оксидазу. Разжижает желатин, пептонизирует молоко и образует флуоресцирующий пигмент.

Нитраты редуцирует до нитритов. Леван из сахарозы не образует. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Индол и сероводород не образует. Хорошо растет при рН среды от 5,0 до 8,5 при температуре от 4 до 35^оС. При температуре 42^оС не растет. В качестве единственного источника углерода использует глюкозу, галактозу, адонит, маннит, глицерин. Не использует сахарозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, сорбит, дульцит. Утилизирует аммиачную и нитратную форму азота, а также аланин, аспарагин, пептон.

Штамм устойчив к ампициллину (200 мкг/мл), чувствителен к тетрациклину (10 мкг/мл), хлорамфениколу (20 мкг/мл), стpептомицину (100 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен, не вирулентен для лабораторных животных.

Хранят штамм на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца или в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее 1 года.

Для лиофилизации штамм выращивают на агаризованном бульоне Хоттингера и клетки смывают средами, обычно применяемыми для лиофилизации.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-328Д выделен из опада зележи косимой в Каменной степи Воронежской обл. в 1981 г. Он характеризуется следующими признаками. Это палочковидные подвижные клетки с полярными жгутиками, размером 0,6-0,7 х 1,2-1,5 мкм. Грамотрицательные, спор не образуют.

Морфологию колоний на питательных средах определяли после роста в течение 4-5 сут. при 28^оС. Колонии на МПА беловато-серые, слизистые, выпуклые к центру, с волнистыми краями, диаметр 5-8 мм. Пигмент зеленый, диффундирующий в среду. Под ультрафиолетовым светом (260 нм) вокруг колоний наблюдается флуоресцирующая зеленая зона. На МПА с 2% глицерина колонии беловатые, густослизистые, выпуклые, крупные. Со временем (через 3-5 сут.) желто-зеленый пигмент становится темно-розовым. На диагностических средах Кинга: Кинг А - пигмент отсутствует, Кинг Б - интенсивный зеленый пигмент и игольчатые кристаллы.

На МПА-косяках штрих белый, блестящий, маслянистый, слабо выпуклый; пигмент зеленый, иногда розовый, друзы кристаллов.

Физиолого-биохимические свойства.

По отношению к кислороду - облигатный аэроб, метаболизм дыхательный. В факторах роста не нуждается. Образует аргининдигидролазу. Желатин разжижает на 5-7 день, на молоке образует желто-зеленый пигмент. Пептонизация молока наблюдается на 10-15 день. Редуцирует нитраты до нитритов. Крахмал и целлюлозу не гидролизует.

Оптимальная температура роста 28-30^оС. Растет при 41^оС. Хорошо растет в пределах рН среды от 5,0 до 8,0. Устойчив к NaCl: растет при 3% и 5% NaCl в среде.

Усваивает как единственный источник углерода арабинозу, ксилозу, глюкозу, глицерин, маннит и не усваивает лактозу, мальтозу, дульцит, инсулин. Использует аммонийные и нитратные формы азота в качестве единственного источника азота.

Штамм устойчив к ампициллину (200 мкг/мл) и чувствителен к тетрациклину (10 мкл/мл), хлорамфениколу (20 мкг/мл), стpептомицину (100 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен и не вирулентен для лабораторных животных. Хранится штамм на косяках картофельного агара с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее 1 года. Для лиофилизации клетки штамма выращивают на агаризованном бульоне Хоттингера и смывают средами, обычно применяемыми для лиофилизации.

Штамм Pseudomonas aureogaiens ВКПМ N В-4117 выделен с ивового опада (авт.св. СССР N 1482188, кл. С 12 N 1/20, 1987).

Все штаммы идентифицированы:

1. По первоисточнику: H.Stolp, D.Gadkari in "The Prokargotes", Berlinea, 1981, v, 1, ch. 61, p.719-741.

2. По определителю: ed. Kried N.R. et al. "Bergey"s manual of Systematic Bacteriology", Baltimore-Londom, 1984, v.1.

П р и м е р. Для получения посадочного элитного материала - укорененных черенков гвоздики ремонтантной генерации М₂ в совхозе "Оранжерейный комплекс" Московской области использовали известный способ выращивания растений в системе непроточного типа. Однако уже в генерации М₁ наблюдалось массовое заражение культивируемых растений возбудителем увядания гвоздики Fusarium oxysporum а к концу третьего месяца культивации выпад растений составлял 35-45% . К тому же в оставшихся растениях скрытая инфекция достигала 70%. Это делало полностью невозможным использование таких маточных растений для производства элитного посадочного материала гвоздики.

Для получения посадочного элитного материала новым способом при выращивании растений в той же непроточной системе в питательный раствор вводили клетки штаммов бактерий, оказывающих антагонистическое действие на возбудителя заболевания. Полученные сравнительные данные приведены в таблице. Их анализ показывает, что по новому способу маточные растения гвоздики можно культивировать в течение 10-12 месяцев. При этом показатели по выпаду растений и по наличию скрытой инфекции значительно ниже при использовании любого из перечисленных в таблице штаммов по сравнению с выращиванием растений без применения штаммов-антагонистов фитопатогена.