способ получения кальмодулина

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЬМОДУЛИНА, включающий измельчение сырья - семенников крупного рогатого скота, гомогенизацию его с водой, высаливание, центрифугирование, осаждение кальмодулина при рН 4,0 - 4,3, очистку и сушку, отличающийся тем, что после измельчения сырье обезжиривают ацетоном и экстрагируют раствором уксусной кислоты при рН 4,7 - 4,9 и 18 - 20^oС в течение 1,5 - 2 ч, высаливание осуществляют хлоридом натрия, который берут из расчета 50 - 70 г/л, а очистку проводят диализом, осаждением кальмодулина элитовым спиртом и переосаждением ацетоном.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области препаративной биохимии, а именно к способу получения кальмодулина - Са²⁺-зависимого низкомолекулярного белка, участвующего в регуляции активности ряда ферментных систем и процессов в клетке, преимущественно фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов.

Известны способы получения кальмодулина, основанные на извлечении этого белка из гомогената тканей мозга, сердца, печени, гипофиза или надпочечников путем высаливания балластных веществ и очистки активной фракции хроматографией на смолах.

Недостаток этих способов заключается в низком выходе кальмодулина (не более 50 мг/кг сырья).

Наиболее близким к заявленному является способ получения кальмодулина, основанный на использовании в качестве сырья семенников животных. Сырье после измельчения и гомогенизации с водой высаливают сернокислым аммонием, надосадочную жидкость отделяют центрифугированием, кальмодулин осаждают в изоэлектрической точке при рН 4,0-4,3, очищают хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе и сефадексе G-100 и активную фракцию сушат.

Схематически технологический процесс представлен на фиг.1.

Однако выход кальмодулина составляет не более 80-86 мг/кг сырья, а активность фосфодиэстеразы в присутствии ионов Са²⁺ и кальмодулина повышается в 8-10 раз.

(Определение активности фосфодиэстеразы проводили классическим методом. За 1 ЕД активности фермента принимали наименьшее его количество, гидролизующее 1 ммоль субстрата - тимидин-3"-(4-нитрофенил)-фосфата за 1 мин при 25^оС и рН 6,0).

Изобретение решает задачу повышения выхода кальмодулина и степени его активирующей способности в отношении фосфодиэстеразы.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения кальмодулина, включающем измельчение сырья - семенников крупного рогатого скота, гомогенизацию его с водой, высаливание, центрифугирование, осаждение кальмодулина при рН 4,0-4,3, очистку и сушку, после измельчения сырье обезжиривают ацетоном и экстрагируют раствором уксусной кислоты при рН 4,7-4,9 и 18-20^оС в течение 1,5-2 ч, высаливание осуществляют хлоридом натрия, который берут из расчета 50-70 г/л, а очистку проводят диализом, осаждением кальмодулина этиловым спиртом и переосаждением ацетоном.

Схематически технологический процесс представлен на фиг.2.

П р и м е р 1. 1 кг семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке, фарш обезжиривают 6 ч 3 л ацетона, осадок отделяют, операцию повторяют еще 2 раза в тех же условиях, осадок сушат 16 ч до удаления запаха ацетона, заливают 1 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты (1 объем к массе исходного сырья) и экстрагируют при рН 4,7 и 18^оС в течение 1,5 ч. Экстракт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 1 ч и направляют на получение фермента гиалуронидазы, а осадок гомогенизируют с 2 л воды (2 объема к исходной массе сырья), добавляют 100 г NaCl (из расчета 50 г/л воды), через 2 ч смесь центрифугируют при 3000 об/мин 1 ч, надосадочную жидкость отделяют, устанавливают рН 4,0 добавлением 6 н. раствора НСl, осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, растворяют в 0,5 л воды, раствор диализуют против воды при 4^оС в течение 16 ч, диализат фильтруют, к фильтрату добавляют 4 объема этилового спирта, через 1 ч осадок отделяют, растворяют в 0,5 л воды, к раствору добавляют 4 объема ацетона, через 1 ч осадок отделяют и сушат до удаления запаха ацетона. Получают 120 мг кальмодулина, обладающего способность повышать активность фосфодиэстеразы в присутствии ионов Са²⁺ в 12 раз.

П р и м е р 2. 1 кг измельченных семенников крупного рогатого скота обезжиривают трижды ацетоном, как описано в примере 1, осадок сушат до удаления запаха ацетона 16 ч, заливают 1,5 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты (1,5 объема к массе сырья) и экстрагируют при рН 4,8 и 19^оС в течение 1,7 ч. Экстракт отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 1 ч), осадок гомогенизируют с 2,5 л воды (2,5 объема к исходной массе сырья), добавляют 150 г NaCl (из расчета 60 г/л воды), через 3 ч смесь центрифугируют (3000 об/мин, 1 ч), надосадочную жидкость отделяют, устанавливают рН 4,15 добавлением 6 н. НСl, осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 30 мин), растворяют в 0,5 л воды, диализуют против воды при 4^оС в течение 16 ч, диализат фильтруют, к фильтрату добавляют 4 объема этилового спирта, через 1 ч осадок отделяют, растворяют в 0,5 л воды, к раствору добавляют 4 объема ацетона, через 1 ч осадок отделяют и сушат до удаления запаха ацетона. Получают 130 мг кальмодулина, обладающего способностью повышать активность фосфодиэстеразы в присутствии ионов Са²⁺ в 14 раз.

П р и м е р 3. 1 кг измельченных семенников крупного рогатого скота обезжиривают трижды ацетоном, как описано в примере 1, осадок сушат 16 ч до удаления запаха ацетона, заливают 2 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты (2 объема к массе сырья) и экстрагируют при рН 4,9 и 20^оС в течение 2 ч. Экстракт отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 1 ч), осадок гомогенизируют с 3 л воды (3 объема к исходной массе сырья), добавляют 210 г NaCl (из расчета 70 г/л воды), через 4 ч смесь центрифугируют (3000 об/мин, 1 ч), надосадочную жидкость отделяют, устанавливают рН 4,3 добавлением 6 н. НСl, осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 30 мин), растворяют в 0,5 л воды, диализуют против воды при 4^оС 16 ч, диализат фильтруют, к фильтрату добавляют 4 объема этилового спирта, через 1 ч осадок отделяют, растворяют в 0,5 л воды, к раствору добавляют 4 объема ацетона, через 1 ч осадок отделяют и сушат до удаления запаха ацетона. Получают 140 мг кальмодулина, обладающего способностью повышать активность фосфодиэстеразы в присутствии ионов Са²⁺ в 16 раз.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей заявляемого объекта и известного способа приведен в таблице.

Из данных таблицы видно, что предложенный способ позволяет получать кальмодулин, идентичный препарату, получаемому известным способом (одинаковые величины молекулярной массы и изоэлектрической точки, отсутствие цистина и триптофана). Однако выход кальмодулина по предложенному способу в 1,5-1,6 раза выше, а степень активации фосфодиэстеразы этим белком в 4-6 раз выше, чем кальмодулином, полученным по известному способу.