способ определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, отличающийся тем, что, с целью определения активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон в конечной концентрации 10^-6 - 10^-7 М и по снижению интенсивности флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к физической химии и криобиохимии и может найти применение при изучении механизмов замораживания - оттаивания, при консервировании сыворотки и клеток крови, тканей и органов.

Известен спектрофотометрический способ определения активности ферментов в переохлажденных растворах. Способ заключается в том, что реакцию проводят в переохлажденной среде, содержащей органические растворители (этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль, ДМСО), точка замерзания которой ниже 0^оС.

Этот способ не позволяет определять фосфодиэстеразную активность непосредственно в замороженном биологическом материале.

Известен способ определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, согласно которому в биологический материал вводят нефлуоресцирующее вещество - флуоресцеиндиацетат, замораживают и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуоресцеина, по которой судят об активности эстеразы. Однако этот способ вообще не позволяет определять активность дифосфоэстеразы.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фосфодиэстеразы, основанный на расщеплении цАМФ змеиным ядом до биологически неактивного 5"-АМФ при инкубации в течение 10 мин при 37^оС. Активность фермента определяют методом Фиске-Суббароу на спектрофотометре при 660 нм.

Недостатком способа является то, что он не позволяет определять активность фосфодиэстеразы непосредственно в замороженном биологическом материале.

Целью изобретения является определение активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон при концентрации 10^-6-10^-7 М и по снижению флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы.

Способ осуществляют следующим образом. В биологический материал (суспензия клеток, гомогенат клеток тканей и органов) вводят субстрат реакции циклический аденозин-3", 5" монофосфат и умбеллиферон в концентрации 10^-6-10^-7 М. Пробы замораживают и определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 1 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 1 нм.

Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата (см. табл.1).

Из табл. 1 следует, что оптимальными концентрациями являются 10^-6-10^-7 М. При концентрации 10^-5 М присутствует нерастворимый осадок умбеллиферона, а при концентрации 10^-8 М чувствительность способа существенно снижается, что не позволяет достоверно судить о ходе реакции.

Способ иллюстрируется следующим примером. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF₂a (Япония) в кварцевых кюветах объемом 3 мл. В качестве среды инкубации использовали 3 мл солевой среды, содержащей 5 ммоль MgCl₂ и 40 ммоль NaCl. В этот объем вносили 50 мкл биологического материала, 50 мкл цАМФ (конечная концентрация 1,9 мМ) и 20 мкл умбеллиферона (конечная концентрация 10^-6 М) и сразу замораживали в парах жидкого азота до -10^оС. После этого измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм.

Данная величина интенсивности флуоресценции служила в качестве контроля фосфодиэстеразной реакции. Через 24 ч хранения при -10^оС определяли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Эту операцию повторяли дважды через 24 ч хранения при -10^оС. В случае осуществления фосфодиэстеразной реакции при комнатной температуре (20^оС) по такой же схеме, она полностью завершалась через 20 мин инкубации.

Полученные данные приведены в табл.2.