способ получения диагностикума для контроля антикоагулянтной терапии

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ ТЕРАПИИ путем взятия донорской крови с консервантом, отделения плазмы, ее центрифугирования, очистки на сульфате бария и отделения целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта, в качестве консерванта используют цитрат с добавлением HEPES и контрикала, а после очистки плазму фильтруют через асбестовые пластины СФ-1 и лиофилизируют в течение 23 - 24 ч при температуре не выше 5^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии и касается способа получения диагностикума для контроля антикоагулянтной терапии.

В качестве прототипа изготовления подобного диагностикума использован метод приготовления субстратной плазмы. Согласно прототипу, цитратную кровь доноров (соотношение крови и цитрата 9: 1) центрифугируют 7 мин при 1500 об/мин и 4^оС, после чего плазму отсасывают в чистую сухую пробирку и повторно центрифугируют при 4500 об/мин и 4^оС в течение 30 мин с целью устранения оставшихся эритроцитов и лейкоцитов и обеднения плазмы тромбоцитами. Бедную тромбоцитами плазму отсасывают и обрабатывают сернокислым барием из расчета 10 г на 100 мл при комнатной температуре, взбалтывая в течение 20 мин. Освобождают плазму от сульфата бария путем центрифугирования также в течение 20 мин при 4000-6000 об/мин. Надосадочный слой, по данным авторов, - это плазма, лишенная факторов II+VII+X. Протромбиновое время с тканевым тромбопластином - более 3 мин. Полученный диагностикум разливают в пенициллиновые флаконы небольшими порциями и хранят при -(20-30)^оС. Повторное замораживание и использование не рекомендуется.

Целью изобретения является повышение стабильности целевого продукта. Цель достигается тем, что в консервант крови доноров вводятся стабилизирующие добавки: введение буферного вещества HEPES создает постоянство среды, обеспечивающее сохраняемость факторов V и VIII; возможная активация остаточного количества фактора VII исключается применением контрикала, а рост микроорганизмов ограничивается азидом натрия. Удаление факторов II+VII+ IX+ X достигается сочетанием обработки исходной плазмы сульфатом бария с последующей фильтрацией через стерильно-фильтрующий асбестовый фильтр высокой плотности. Сублимацию проводят по щадящему режиму, обеспечивающему конечную температуру продукта, не превышающую 5^оС.

Технология изготовления субстратной плазмы, лишенной факторов II+VII+IX+X (диагностикума).

Кровь берут от 15 доноров и более в соответствии с "Инструкцией по заготовке консервированной донорской крови", утвержденной МЗ СССР 3 августа 1984 г. вне боксированных операционных с соблюдением правил асептики и "Инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови", утвержденной МЗ СССР 17 октября 1987 г. , в силиконированные флаконы до метки 50 мл с консервантом; соотношение крови и консерванта 9: 1. Пропись консерванта представлена ниже:

1,0 мл 10% раствора

азида натрия - NaN_з

3,8 г цитрата натрия - C₆H₅Na₃2H₂O

0,05 мл контрикала

8,925 г HEPES - C₈H₁₈N₂O₄

100,0 мл дистиллированной воды - H₂O.

Поскольку продукт (диагностикум) в последующем используется лишь в лабораторных целях, фактор стерильности строгого значения не имеет. Кровь тотчас центрифугируют при 400хg и +(0-5)^оС в течение 10 мин, плазму отбирают и повторно ценрифугируют 30 мин при 2000-2200 хg и той же температуре. К полученной бедной тромбоцитами плазме добавляют сульфат бария (для рентгеноскопии) из расчета 100 мг/мл и перемешивают на магнитной мешалке 20 мин. Осадок адсорбента удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 2000-2200 хg и температуре 0-5^оС на центрифуге марки К-24, РС-6 или аналогичных. Супернатант отсасывают и фильтруют через асбестовый фильтр марки СФ-1 (1/2 толщины пластины), добиваясь средней скорости фильтрации 25 мл в 1 ч. Полученный продукт контролируют на длительность протромбинового времени с тканевым тромбопластином из кадаверного мозга. Протромбиновое время должно быть быть более 10 мин (обычно оно бывает более 12-15 мин). Если сгусток образуется быстрее 10 мин, фильтрацию через асбест повторяют, также используя 1/2 толщины пластины. Полученный продукт разливают по 1 мл в силиконированные пенициллиновые флаконы вместимостью 10 мл, которые устанавливают на плиту котла сублиматора марки ЛЗ-9 (производство ЧССР) и проводят замораживание и закалку продукта непосредственно в аппарате, постепенно понижая температуру в нем до -(37-57)^оС - на это уходит 3-4 ч. После закалки включают вакуумный насос и понижают давление до 510^-1-510^-2 мм рт. ст. ; через 2 ч подключают подогрев плиты. Повышение температуры производят постепенно; конечная температура продукта - не выше 5^оС. Общая продолжительность сушки 23-24 ч. Заканчивая процесс сублимации, выравнивают давление в котле газообразным азотом. После снятия крышки котла закрывают флаконы чистыми резиновыми пробками, достают их из сублиматора и плотно завальцовывают алюминиевыми колпачками. Для обеспечения большей герметичности флаконы покрывают пастой Унна или мастикой.

Оценку качества лиофилизированного диагностикума проводили по следующим параметрам: 1) активности протромбинового комплекса с тканевым тромбопластином производства Кировского НИИ гематологии и переливания крови из кадаверного мозга; 2) активности факторов V и VIII (одностадийные методы: Перлик и Лангделл в модификации Л. П. Папаян и П. В. Хроловой соответственно); 3) концентрации фибриногена по "суховоздушному" методу Р. А. Рутберг (коэффициент перерасчета - по данным Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови). Сохраняемость диагностикума исследования в течение 1 года. Полученные результаты представлены в табл. 1.

П р и м е р. Способ получения диагностикума субстратной плазмы, лишенной факторов II+VII+IX+X, серии 02.06.89.

Бутылки емкостью 50 мл и пенициллиновые пузырьки по 10 мл, химические стаканы и пипетки силиконируют. Готовят консервант, в состав которого вводят 1,9 г цитрата натрия, 0,5 мл 10% -ного раствора азида натрия, 0,025 мл контрикала, 4,4630 г HEPES^lа и 50 мл дистиллированной воды. Раствор перемешивают и фильтруют через обеззоленный фильтр, затем разливают в силиконированные бутылки емкостью по 50 мл по 3,0 мл в каждую, укупоривают пробками, завальцовывают алюминиевыми колпачками.

Кровь от каждого из 15 доноров берут во флаконы с консервантом до метки 30 мл и центрифугируют при 430 хg 0-5^о в течение 10 мин на центрифуге марки РС-6. Плазму отделяют в силиконированный стакан, разливают по центрифужным пробиркам и центрифугируют при 2000хg и 0-5^оС 30 мин на той же центрифуге. Плазму в каждой пробирке отделяют от примеси оставшихся клеток и собирают в общую емкость - силиконированный стакан. К 200 мл полученной плазмы добавляют 20 г сульфата бария и перемешивают в течение 20 мин на магнитной мешалке, после чего с целью освобождения от осадка BaSO₄ центрифугируют 20 мин при 2200 хg и температуре 0-5^оС на центрифуге РС-6. Супернатант в количестве 150 мл фильтруют через 1/2 толщины асбестового фильтра СФ-1 со скоростью 25 мл в час при охлаждении (колба Бунзена находится в ледяной бане). Содержимое колбы сливают в силиконированный химический стакан. Гильзу поршневого дозатора А1-5, откалиброванного на 1 мл, опускают в стакан с плазмой и производят розлив продукта в силиконированные пенициллиновые флаконы емкостью 10 мл по 1,0 мл в каждый. Флаконы устанавливают на плиту котла сублиматора, закрывают крышку; температура плиты при этом равна -(0-5)^оС. Замораживание начали в 15,00 ч. Через 30 мин температуру плиты довели до -40^оС, после чего продолжали до 18 ч замораживание и закалку; температура плиты равнялась -72^оС, продукта -54^оС.

Контроль готовой продукции серии 02.06.89:

Протромбиновое время с тканевым тромбопластином производства Кировского НИИГ и ПК - более 15 мин; через 6 и 12 месяцев хранения - также более 15 мин; активность фактора У-95, 100 и 64% соответственно; активность фактора УШ-100, 90 и 65% ; концентрация фибриногена - 1,8, 2,0 и 2,0 г/л. Растворимость исходного продукта менее 1 мин, через 6 и 12 месяцев хранения не более 1,5 мин.

Специфичность полученного диагностикума была проверена к факторам протромбинового комплекса в тесте Оврена при проведении определений с плазмой больных, получавших антикоагулянт непрямого действия (см. табл. 2).

Применение указанного диагностикума в тесте Оврена дает более объективные результаты, чем тест Квика.