н-фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов или их аналогов

Формула изобретения

Н-Фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов общей формулы

XO-H

где X - остаток холестерина или тестостерона,

в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов или их аналогов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биорганической химии, а именно к новым химическим соединениям - Н-фосфонатам гидроксилсодержащих стероидов общей формулы I XO--H где X - остаток гидроксилсодержащего стероида,

например:

холестерина (Chs)

тестостерона (TS) которые могут быть использованы как исходные реагенты для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов и их аналогов.

Известен лишь один пример твердофазного синтеза холестеринсодержащих олигонуклеотидов, основанный на использовании 2-(холестерилоксикарбониламино)этиламина формулы II [1] NH(CH₂)₂NH-O-холестерин который получают из холестерилхлорформиата и этилендиамина (выход - 76% ). С помощью этого реагента получен ряд олигодезоксирибонуклеотидов с остатком холестерина, связанным с 31-концевым межнуклеотидным фосфатом. Выход холестеринсодержащего олигонуклеотида - 50% .

Недостатком данного метода является сравнительно низкий выход стероидных производных олигонуклеотидов, а также то, что межнуклеотидная связь, содержащая холестериновый остаток, существует в виде R- и S-стереоизомеров по атому фосфора, различающихся по своим физико-химическим свойствам, в частности, образующих комплексы различной устойчивости с нуклеиновыми кислотами.

Твердофазный синтез олигонуклеотидов и их аналогов является в настоящее время наиболее широко используемым методом вследствие своей быстроты и эффективности. Испытания стероидных производных олигонуклеотидов в клеточных системах показали их перспективность в качестве средств подавления развития вирусов. Поэтому весьма актуальной задачей является повышение выхода стероидных производных олигонуклеотидов и их аналогов при твердофазном синтезе этих производных.

Указанная задача решается тем, что в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидсодержащих олигонуклеотидов и их аналогов используют новые химические соединения - Н-фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов формулы 1, которые получают из соответствующих стероидов обработкой триимидазолидом фосфора с последующим гидролизом водой и выделением хроматографией на силикагеле.

Синтезированные Н-фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов были использованы в качестве реагентов для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов дезоксирибо-ряда, рибо-ряда и 21-0-метилрибо-ряла, предварительно полученных твердофазным Н-фосфонатным методом. Полученные результаты подтверждают возможность твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов с использованием данного реагента, при этом выход целевых продуктов составляет 80-90% . Проведение реакции в твердофазном варианте существенно облегчает процедуру избытка реагентов и может быть легко автоматизировано.

П р и м е р 1. Синтез Н-фосфонатов гидроксилсодержащих стероидов.

а) Синтез Н-фосфоната холестерина.

Колбу заполняют аргоном 1,2 г (17,5 ммоль) имидазола, предварительно высушенного над P₂O₅ при 1-2 мм рт. ст. , растворяют в 60 мл абс. ацетонитрила и охлаждают льдом. Затем при перемешивании добавляют 0,35 мл (5,25 ммоль) PCl₃ и 1,5 мл (18 ммоль) триэтиламина. Через 15 мин по каплям добавляют раствор предварительно высушенного холестерина (0,5 г, 1,25 ммоль) в 60 мл абс. хлороформа в течение 30 мин, затем охлаждение убирают и продолжают перемешивание еще 2 ч. За ходом реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ - этанол (9: 1). Затем реакционную смесь разлагают добавлением 15 мл воды и упаривают досуха. Смесь растворяют в хлороформе (75 мл), экстрагируют водой (2 x 50 мл). Органическую фазу после отделения высушивают безводным Na₂SO₄, упаривают и хроматографируют на силикагеле (колонка 150 мл, градиент концентрации этанола (0 -> 50% ) в хлороформе, содержащем 1% триэтиламина). Фракции, содержащие продукт с R_f = = 0,23 (ТСХ, система хлороформ - этанол 6: 4), упаривают досуха. Выход 0,6 г (85% ).

Продукт гомогенен по данным ТСХ и дает положительный нингидриновый тест.

ИК-спектр, см^-1: 1000, 1060, 1090 (цикл), 1240 (Р= О), 1340 (-СН), 1460 (С-СН₃), 1600 (С= С), 2400, 2500 (Р-ОН), 2690 (Р-Н), 2860, 2950 (-СН₂-, -СН₃, С-Н).

³¹Р-ЯМР, _м.д. (CDCl₃): 0,86 (J = 618 Гц)

¹Н-ЯМР, _м.д. (CDCl₃): 0,82 (S, 3Н, 13-CH₃), 0,88 (S, H, -(CH₃)₂), 0,95 (S, 3H, 20-CH₂), 1,31 (t, 9Н, СН₃СН₂-N), 0,8-2,40 (m, 3Н, цикл), 3,03 (g, 6H, CH₃CH₂-N), 3,94 (m, 3H, 10-CH₃), 5,27 (Sm, 1H, 3-H), 6,98 (d, 1H, P-H (J = 618 Гц)), 8,35 (S, 1H, N-H).

Сигналы фосфорсодержащей части молекулы в ИК, ³¹Р- и ¹Н-ЯМР-спектрах хорошо коррелируют с литературными данными [2] . Сигналы стероидной части молекулы в спектрах ИК- и ¹Н-ЯМР также согласуются со справочными данными [3] .

б) Синтез Н-фосфоната тестостерона.

Синтез ведут аналогично описанному выше. Выход 0,49 г (69% ). R_f= 0,29 (ТСХ, система хлороформ-этанол 6: 4).

ИК-спектр, см^-1: 1220 (P= O), 1460 (С-СН₃), 1000-1100 (цикл), 1600 (С= С), 1680 (С= O), 2500 (P-OH), 2600 (P-H), 2800-3000 (C-H, -CH₂, -CH₃).

УФ-спектр (этанол): _max 241 нм, lg = = 4,18.

³¹Р-ЯМР, _м.д. (CDCl₃): 3,43 м. д. (J = 608 Гц).

¹Н-ЯМР, _м.д. (CDCl₃): 0,68 (S, 3H, 13-CH₃), 1,34 (S, 3H, 10-CH₃), 1,21 (t, 9H, CH₃-CH₂-N), 0,80-2,1 (m, 17H, цикл), 2,94 (g, 6H, CH₃-CH₂-N), 3,95 (m, 1H, 10-CH₃), 5,57 (Sm, 1H, 17-Н), 6,68 (d, 1H, P-H (J = 608 Гц)), 8,11 (S, 1H, N-H).

Данные ИК, УФ и ЯМР согласуются с литературными данными [2-3] .

П р и м е р 2. Синтез стероидных производных олигонуклеотидов.

Для синтеза использованы полученные твердофазным методом на автоматическом синтезаторе "Виктория" [4] защищенные олигонуклеотиды в виде Н-фосфонатов, связанные по 3¹-концу с полимерным носителем и имеющие на 5¹-конце свободную оксигруппу.

а) Синтез холестеринового производного декатимидилата

ChSpT(pT)₉

К высушенной навеске (8 мг, емкость 70 мкмоль/г по первому нуклеотидному звену, т. е. 0,5 мкмоль) полимер-связанного декатимидилата с Н-фосфонатными межнуклеотидными связями, добавляют 50 мкл абс. пиридина, 25 мкл абс. ацетонитрила, 25 мкл 0,1 М раствора (25 мкмоль) Н-фосфоната холестерина в хлороформе и 6 мкл (75 мкмоль) пивалоилхлорида. Смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, промывают полимерный носитель пиридином, добавляют 100 мкл 0,2 М раствора I₁ в смеси пиридин - вод (98: 2), выдерживают 30 мин и промывают ацетоном. Затем носитель обрабатывают 1 мл конц. NH₄OH в течение 1 ч, раствор сливают, упаривают досуха, растворяют в 1 мл воды и наносят на колонку с ионообменным сорбентом. Выделенные фракции вновь упаривают, растворяют в воде и наносят на колонку с обращенной фазой. Условия хроматографии приведены в таблице. После выделения фракцию, содержащую целевой продукт, упаривают досуха, растворяют в 100 мкл воды и добавляют по каплям в 1 мл 2% -ного раствора LiClO₄ в ацетоне. Выпавший осадок литиевой соли олигонуклеотида отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и сушат при 14^-2 мм рт. ст. Выход и характеристики полученного холестеринового производного декатимидилата приведены в таблице.

б) Синтез тестостеронового производного декатимидилата.

TSpT(pT)₉

Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а. Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.

в) Синтез холестеринового производного декауридилата.

ChSpU(pU)₉

Синтез ведут аналогично описанному в примере 2а, при этом в процедуру выделения вводят дополнительную стадию: полученный в результате ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии стероидсодержащий олигонуклеоимд с тетрагидропиранильными защитными группами в 2¹-положении рибозы обрабатывают 1 мл 0,01 М HCl в течение 2 ч при 50^оС. Затем раствор нейтрализуют конц. NH₄OH, упаривают досуха и растворяют в 1 мл воды. Затем наносят на колонку с обращенной фазой (условия хроматографии приведены в таблице) и после хроматографии выделяют целевой продукт аналогично описанному в примере 2а. Выход и характеристики продукта приведены в таблице.

г) Синтез тестостеронового производного декауридилата.

TSpU(pU)₉

Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2в. Результаты приведены в таблице.

д) Синтез холестеринового производного дека(2¹-0-метилуридилата)

ChSpUm(pUm)₉

Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а. Результаты приведены в таблице.

е) Синтез тестостеронового производного дека(2¹-0-метилуридилата)

TSpUm(pUm)₉

Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а.

Результаты приведены в таблице. (56) Letsinger R. L. , Zhang G. , Sun D. K. , Ikeuchi T. , Sarin P. S. PNAS, 1989, v. 86, N 17, p. 6553-6556.

Garegg P. J. , Regberg T. , Stawinski J. Chem. Ser. 1986, v. 26, N 1, p. 59-62.

The Sadtler Standard Spectra. Philadelphia Sadtler research Lab. 1966-1988.

Веньяминова А. Г. , Левина А. С. , Репкова М. Н. , Ченцова Н. А. Биоорганическая химия: 1989, т. 15, N 6, с. 844-847.