способ прогнозирования течения хронического панкреатита

Формула изобретения

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ПАНКРЕАТИТА путем определения в исследуемой пробе сенсибилизации лимфоцитов к ткани поджелудочной железы с помощью реакции бласттрансформации и учетом результатов реакции, отличающийся тем, что реакцию бласттрансформации проводят в течение 96 ч, а учет бластобразования осуществляют радиометрически по числу фиксируемых импульсов за 100 с, далее учитывают соотношение числа импульсов в пробе с антигеном к числу импульсов контрольной пробы и при значении отношения 1,1 - 1,8 прогнозируют обострение хронического панкреатита, а при значении, меньшем 1,1, прогнозируют ремиссию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к гастроэнтерологии, и может быть использовано в иммунологическом прогнозе течения хронического панкреатита.

При исследовании больных с заболеваниями поджелудочной железы важным является развитие методов прогноза заболевания, выяснение факторов риска.

При патологических состояниях, затрагивающих экзокринную часть поджелудочной железы, часто поступает в кровоток избыточное количество ферментов.

Известен способ прогнозирования течения хронического панкреатита путем биохимического определения ферментов в крови больного.

Недостатками известного способа являются низкие точность, чувствительность, а также неспецифичность, поскольку повышенное количество ферментов поджелудочной железы выделяется и при некоторых других заболеваниях; повышенная активность ферментов наблюдается только в первые дни заболевания, затем она быстро снижается [1] .

Наиболее близким к заявляемому способу является известный способ прогнозирования течения хронического панкреатита путем иммунологического исследования сенсибилизации лимфоцитов к ткани поджелудочной железы с помощью реакции бласттрансформации с использованием водно-солевого экстракта ткани поджелудочной железы в качестве антигена, который добавляют в питательную среду, содержащую среду 199, сыворотку крови, пенициллин, стрептомицин, а также смесь крови больного с гепарином, причем пробу термостатируют при 37^оС в течение 5 сут и параллельно готовят контрольную пробу с фитогемагглютинином с последующими окраской клеток и учетом бластообразования морфологическим способом [2] . При содержании бластных клеток больше 1% прогнозируют обострение хронического панкреатита.

По сравнению с известным биохимическим способом прогноза [1] известный иммунологический способ [2] является более чувствительным и специфичным, однако точность известного способа является недостаточной и составляет 48,5% [2] .

Недостаточная точность известного способа обусловлена неточностью морфологического способа, присутствием субъективного фактора при оценке бластообразования и его учете. Кроме того, известный способ является длительным, трудоемким, непродуктивным из-за необходимости окраски клеток и подсчета лимфоцитов, бластов и бластоподобных переходных форм вручную под микроскопом, а также проведения реакции бластотрансформации в течение 5 сут.

Целью заявляемого способа прогнозирования течения хронического панкреатита является повышение точности прогноза.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе прогнозирования течения хронического панкреатита путем исследования сенсибилизации лимфоцитов к ткани поджелудочной железы с помощью реакции бласттрансформации с использованием водно-солевого экстракта ткани поджелудочной железы в качестве антигена, который добавляют в питательную среду, содержащую среду 199, сыворотку крови, пенициллин, стрептомицин, а также смесь крови больного с гепарином, причем пробу термостатируют при 37^оС и параллельно готовят контрольную пробу с фитогемагглютинином с последующим учетом бластообразования, реакцию бласттрансформации проводят в течение 96 ч, а учет бластообразования осуществляют радиометрически по числу фиксируемых импульсов за 10 с, и при значении отношения числа импульсов, зафиксированных за 100 с, при анализе пробы с антигеном, к числу импульсов, зафиксированных за 100 с при анализе контрольной пробы, равном 1,1-1,8, прогнозируют обострение хронического панкреатита, а при значении отношения меньшем 1,1 прогнозируют ремиссию.

В процентном отношении точность прогноза по заявляемому способу составляет 72% , т. к. при обследовании 100 больных прогноз подтвердился у 72 человек. Точность прогноза по прототипу составляет 48,5% . Такой результат достигается за счет осуществления радиометрического учета бластов вместо менее точного морфологического, проведения реакции в течение оптимального времени термостатирования 96 ч, а также оценки прогноза по отношению числа импульсов за 100 с, при реакции бласттрансформации с антигеном к числу импульсов за 100 с в контрольном опыте.

Радиометрический учет исключает субъективный фактор в оценке бластов, лимфоцитов, переходных форм и их подсчете визуально при морфологическом способе, что повышает точность прогноза.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов крови обследуемого больного, стимулируемая антигеном поджелудочной железы человека, проводилась в течение 96 ч. Это время соответствует образованию максимального количества бластов. Если реакцию проводить в течение времени, меньшего 96 ч, то результаты прогноза будут недостоверными, т. к. не все лимфоциты крови вступят в реакцию. Увеличение же времени реакции будет непродуктивным, т. к. число образовавшихся бластов остается постоянным, а побочные иммунологические реакции, проходящие в этом случае, снижают точность подсчета, а, значит, и точность прогноза.

Повышает точность прогноза и тот факт, что прогнозируют течение болезни не по абсолютному числу бластов, а по отношению числа импульсов в опыте к числу импульсов в контроле и прогнозируют обострение в довольно узком интервале этих отношений 1,1-1,8; при отношении меньше 1,1 прогнозируют ремиссию, а если отношение больше 1,8 - констатируют острый или обострение хронического панкреатита.

Кроме того, изобретение обеспечивает и другие преимущества по сравнению с прототипом:

- способ позволяет проводить прогноз серийным методом для большого количества больных, т. к. способ менее трудоемкий, позволяет проводить большее число измерений в единицу времени;

- способ осуществляется за более короткое время, чем по прототипу, т. к. радиометрический учет осуществляют быстрее, чем морфологический; термостатирование осуществляют в течение 96 ч (по прототипу 120 ч); нет необходимости в процедуре окрашивания бластных клеток.

В основу способа положено свойство лимфоцитов отвечать усилением синтеза ДНК, под воздействием антигенного (митогенного) стимула в реакции бласттрансформации. При проведении этой реакции в присутствии тимидина - Н³ (сцинтилляционной метки) последний включается в матрицу ДНК в S₂-фазе клеточного цикла. Количество полученных ДНК-Н³регистрируют способом жидкостно-сцинтилляционной радиометрии.

Способ осуществляют следующим образом. Из вены больного берут 2 мл крови и помещают в стерильный флакон, в котором находится 40 ед. гепарина. Затем в стерильном боксе и с помощью стерильных пипеток готовят питательную смесь для инкубации объемом 100 мл, содержащую 80 мл среды 199 и 20 мл сыворотки крови человека IV группы с добавлением антибиотиков для поддержания стерильности среды: по 100 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл смеси. В стерильную пробирку вносят 3 мл питательной смеси, 0,1 мл гепаринизированной крови больного и 0,1 мл антигена поджелудочной железы человека. Параллельно готовят контрольный опыт: в стерильную пробирку помещают питательную среду и кровь больного. Обе пробирки термостатируют при 37^оС в течение 96 ч. За 5 ч до окончания термостатирования в пробирки добавляют по 0,1 мл тимидина - Н³ в качестве сцинтилляционной метки.

После завершения культивации производят обработку культур, меченных тимидином - Н³, с целью отмывания клеток от невключившейся метки и подготовки проб для радиометрии в жидком сцинтилляторе. Для этого в обе пробирки приливают по 2 мл 6% -ного раствора уксусной кислоты, смесь встряхивают на водоворотном смесителе, центрифугируют 15 мин при скорости вращения 1500 об/мин. С помощью водоструйного насоса удаляют надосадочную жидкость, приливают 2 мл 3% -ного раствора уксусной кислоты и пробы вновь центрифугируют 15 мин. Отмывание 3% -ной уксусной кислотой осуществляют всего 3 раза. Затем к осадку приливают 2 мл 5% -ного раствора трихлоруксусной кислоты и пробы помещают в холодильник (+ 4^оС) на 30 мин. Пробы вновь центрифугируют и обрабатывают второй раз трихлоруксусной кислотой. Надосадочную жидкость удаляют и в пробирки приливают по 0,4 мл дистиллированной воды. В счетные флаконы с помощью полуавтоматической пипетки переносят 0,1 мл суспензии осадка в дистиллированной воде и добавляют по 0,05 мл нормального раствора едкого натра и пергидроля. Флаконы закрывают пробкой и в наклонном положении под углом 30^о помещают на 30 мин в термостат при 60^оС. После охлаждения до комнатной температуры во флаконы наливают по 4 мл сцинтилляционной жидкости марки "ЖС-8" и помещают в кассеты для радиометрии. Для измерения пользуются автоматическим счетчиком "СБС-2". Измеряемая величина - количество импульсов за 100 с. Интенсивность реакции бласттрансформации с использованием в качестве стимулятора антигена поджелудочной железы выражают индексом стимуляции (ИС), который определяют по формуле: ИС=

При значении ИС в пределах 1,1-1,8 прогнозируют обострение хронического панкреатита, при ИС < 1,1 прогнозируют ремиссию. В случае, если ИС > 1,8, можно говорить об остром или обострении хронического панкреатита. Чтобы убедиться в достоверности прогноза для обследуемого больного, необходимо определить состояние иммунных клеток больного в момент определения ИС, их общую способность к реакции бласттрансформации. Для этого параллельно с пробой с антигеном (описанной выше) ставят пробу с митогеном - фитогемагглютинином. Методика проведения реакции та же, что и с антигеном. При этом доза фитогемагглютинина составляет 0,05 мл его раствора в среде 199 концентрацией 500 мкг/мл, а инкубация длится 72 ч. Затем по формуле ИС= определяют индекс стимуляции, характеризующий способность лимфоцитов к реакции бласттрансформации. При значении ИС 50 считают, что реактивность лимфоцитов нормальная и метод прогнозирования с антигеном для такого больного применим.

Для приготовления антигена поджелудочной железы используют ткани органа, полученного из трупа молодого человека с I (0) группой крови, погибшего от случайной травмы, не более чем через 2 ч после смерти. Кусочки органа освобождают от сосудов, оболочек и жировой ткани, тщательно отмывают физиологическим раствором, измельчают, а затем тщательно растирают в ступе с давлением стерильного кварцевого песка. Тканевую кашицу взвешивают и разводят 0,9% -ным раствором хлорида натрия из расчета 2: 10. Затем смесь трижды поочередно замораживают в морозильной камере бытового холодильника и трижды оттаивают, причем при оттаивании производят тщательное перемешивание тканевой кашицы. После этого массу центрифугируют в течение 1 ч, при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. В качестве консерванта к содержимому добавляют 1-2 капли 0,05% -ного раствора карболовой кислоты. Антиген помещают в стерильные флаконы, герметически закупоривают и хранят в морозильной камере бытового холодильника.

П р и м е р 1. Больной П. , 34 года, поступил в гастроэнтерологическое отделение с диагнозом: хронический алкогольный панкреатит в стадии обострения. Жалобы на боли в левом подреберье с иррадиацией в поясницу, усиливающиеся через 30 мин после еды, тошноту. Болеет 5 лет. При объективном исследовании: резкая пальпаторная болезненность в области головки и тела поджелудочной железы. При лабораторном исследовании: амилаза крови 86 г/лч, амилаза мочи 220 г/лч. Сахар крови 7,2 ммоль/л. Диагноз подтвержден при ультразвуковом исследовании (УЗИ). Была осуществлена попытка прогноза течения заболевания путем постановки реакции бласттрансформации с антигеном поджелудочной железы, и учета количества бластов морфологическим способом (прототип). При этом процент бластных форм при поступлении в стационар составил 5,5 (норма до 1,0% ), а после лечения - 0,9% . Согласно полученному прогнозу у больного ожидалась стойкая ремиссия. При осуществлении прогноза по заявляемому способу ИС с фитогемагглютинином 58,3, ИС с антигеном поджелудочной железы 2,14. После проведения лечения состояние улучшилось. Перед выпиской амилаза крови составила 30 г/лч, мочи - 120 г/лч, сахар крови - 6,2 ммоль/л, ИС с фитогемагглютинином 52, ИС с антигеном поджелудочной железы 1,76. В связи с сохранением повышенного ИС при последнем исследовании решено, что у больного в ближайшие 2-3 месяца наступит рецидив, дана рекомендация явиться больному в клинику через 2 месяца для обследования, но в назначенное время он не явился. Через 2,5 месяца больной госпитализирован с выраженным обострением заболевания.

П р и м е р 2. Больная Х. , 48 лет, поступила в гастроэнтерологическое отделение с диагнозом: хронический рецидивирующий панкреатит в стадии обострения. Жалобы на постоянные жгучие боли в эпигастрии и левом подреберье с иррадиацией в предсердечную область, тошноту, рвоту, поносы. Болеет около 5 лет. При пальпации: в зоне поджелудочной железы прощупывается плотный болезненный тяж. При лабораторном обледовании обнаружено повышение уровня амилазы мочи до 250 г/лч.

Рентгенологически выявлены признаки панкреатита (развернуто кольцо 12-перстной кишки, симптом Фростберга). При прогнозировании течения заболевания по прототипу определено количество бластных клеток в период поступления в клинику, равное 8% , при выписке это число соответствовало 4,1% . Согласно прогнозу по прототипу больную в ближайшее время ожидало обострение хронического панкреатита. При осуществлении прогноза по заявляемому способу ИС с фитогемагглютинином составил 60,5, ИС антигеном поджелудочной железы - 12,42. После проведенного лечения боли значительно уменьшились, уровень амилазы мочи нормализовался и составил 120 г/лч. ИС с фитогемагглютинином после проведенного лечения составил 68,4, ИС с антигеном поджелудочной железы - 1,02. Больной прогнозирована ремиссия. После выписки из отделения в течение 2 лет обострения не было.

П р и м е р 3. Больная С. , 45 лет, поступила в гастроэнтерологическое отделение с диагнозом: хронический энтерит в стадии обострения. Жалобы на частый жидкий стул с остатками непереваренной пищи, потерю веса, резкую общую слабость. Болеет 3 года, когда беспокоили боли в правом подреберье, лечилась по поводу хронического холецистита. Боли справа утихли, но появились поносы. При объективном исследовании: пониженное питание, бледность кожи и слизистых, кожа сухая. Живот мягкий, при пальпации разлитая болезненность вокруг пупка, урчание в слепой кишке. При лабораторном обследовании: анемия (эритроциты 2,610¹² г/л, гемоглобин 100 г/л), кал на яйца глистов - яйца не обнаружены. Копрограмма: мышечные волокна, нейтральный жир, мыла, клетчатка, жирные кислоты - большое количество. Рентгенологическое исследование желудка с пассажем по кишечнику: энтерит с гипермоторной дискинезией. Больной проводилось лечение, показанное при хроническом энтерите. Эффекта не было. При дообследовании: ИС с фитогемагглютинином 70,4, ИС с антигеном поджелудочной железы 1,82. На основании данных дообследования заподозрен хронический панкреатит в стадии обострения. Исследован уровень амилазы крови и мочи. Он был в норме. Сахар крови: 7,0 ммоль/л. Данные УЗИ поджелудочной железы: ткань неравномерно уплотнена, эхогенность высокая, контуры нечеткие. При обследовании с помощью компьютерной томографии органов брюшной полости и забрюшинного пространства: признаки индуративного панкреатита. После получения этих данных с учетом И = 1,82 был поставлен диагноз: хронический вторичный (вследствие хронического холецистита) латентный (безболевой) панкреатит с выраженной внешнесекреторной и внутрисекреторной недостаточностью поджелудочной железы. Вторичный энтерит в стадии обострения. Хронический холецистит вне обострения. После проведения лечения состояние больной улучшилось: прекратились поносы, стала набирать вес. При проведении реакции бласттрансформации с антигеном поджелудочной железы по прототипу процент бластообразования составил 3,1% . При определении ИС по заявляемому способу он составил 1,0. По прототипу реорганизовали обострение панкреатита, а по заявляемому способу - ремиссию. После лечения больная не обращалась в клинику в течение 1,5 лет.

П р и м е р 4. Больная К. , 51 год, поступила в гастроэнтерологическое отделение диагнозом: хронический панкреатит, болевая форма, в стадии обострения.

В жалобах обращали на себя внимание постоянные интенсивные боли в левой половине живота, значительная потеря веса. Давность заболевания 8 месяцев. При объективном исследовании: слева от пупка пальпируется плотный болезненный тяж. При лабораторных исследованиях: анемия (эритроциты 2,810¹² г/л, гемоглобин 98 г/л), ускорение СОЭ до 28 мм/ч, амилаза крови 62 г/лч, амилаза мочи 180 г/лч. При рентгенологическом исследовании желудка органической патологии не выявлено. УЗИ поджелудочной железы: ткань однородно уплотнена, контуры волнистые, размеры нормальные; ИС с фитогемагглютинином 62,3, ИС с антигеном поджелудочной железы 1,08. Процент бластных клеток по прототипу 7,2% . Согласно прогнозу по заявляемому способу обострение хронического панкреатита у больной не ожидалось. Однако по прогнозу по способу-прототипу ожидалось как раз обострение процесса. Больной было проведено лечение, показанное при хроническом панкреатите. Эффекта не было. Через 3 месяца больная вновь поступила в клинику. Боли усилились, прогрессивно теряла в весе, пальпируемое образование слева от пупка увеличилось. Нарастала анемия. При ирригоскопии - опухоль левой половины поперечно-ободочной кишки. Больная переведена в хирургическое отделение. (56) 1. Вельбри С. К. Иммунологическая диагностика заболеваний поджелудочной железы. М. : Медицина, 1985, с. 6-7.

2. Чернушенко Е. Ф. и др. Аутоиммунные процессы и их роль в клинике внутренних болезней. Киев: Здоровье, 1985, с. 152-153.