способ определения пармидина в биологических жидкостях

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРМИДИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ, включающий хроматографическое разделение в обращенной фазе и спектрофотометрирование, отличающийся тем, что предварительно биологическая проба обрабатывается смесью 0,1 н. серная кислота - этанол в объемном соотношении 10 - 50 : 50 - 90 с последующим центрифугированием и хроматографированием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам анализа лекарственных препаратов в биологических жидкостях, и может быть использовано для определения скорости элиминации пармидина при изучении активности метаболизирующих ферментов печени человека.

Известен способ определения пармидина и его метаболитов в биологических жидкостях посредством экстракционного извлечения препарата с последующим хроматографическим определением.

Недостатком данного способа является использование жидкостной экстракции хлороформом пармидина (степень извлечения 70-80% ), соэкстракции веществ биологического происхождения и, главное, возможность разложения препарата в процессе упаривания хлороформного экстракта. Применение инертного газа азота, импортного оборудования затрудняет использование данной методики в клинической практике.

Аналогов по результатам патентного поиска не выявлено.

Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа.

Цель достигается с помощью метода осаждения балластных компонентов с последующим центрифугированием и хроматографированием методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что предварительно биологическая проба центрифугируется, обрабатывается смесью 0,1N серная кислота - этанол в объемном соотношении 30: 70, центрифугируется и аликвотная часть супернатанта вводится в хроматограф. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна" и "существенные отличия".

Способ осуществляется следующим образом. Для осаждения плотного осадка биологическую пробу центрифугируют (3000 об/мин в течение 20 мин). К 200 мкл супернатанта добавляют 200 мкл смеси 0,1N серной кислоты в этаноле (30: 70, об. % ) и встряхивают на вибраторе в течение 1 мин, после чего пробу центрифугируют (7000 об/мин в течение 20 мин) и 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф. Условия хроматографирования: хроматограф "Милихром", колонка 64х2 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом "Силасорб-С₁₈", подвижная фаза ацетонитрил-вода (20: 80, об. % ), расход 100 мкл/мин. Длина волны детектора - 264 нм.

Основными хроматографическими параметрами, характеризующими разделение компонентов анализируемой пробы, являются относительное удерживание - и разрешение соседних пиков - R_s. Причем под оптимальными условиями разделения понимают полное разрешение соседних пиков (R_s > 1,5) при наименьшей затрате времени.

В настоящем исследовании выбор оптимальных условий сводился к полному разделению пармидина и компонентов биологической пробы. Как видно из данных табл. 1, наилучшие условия достигаются при соотношении вода-ацетонитрил (75-80): (20-25). Соответствующая хроматограмма представлена на чертеже, где 1 - бискарбаминовый эфир 2,6-бис(оксиметил)пиридина; 2 - карбаминовый эфир 2,6-бис(оксиметил)пиридина; 3 - N-метилкарбаминовый эфир 2,6-бис(оксиметил)пиридина; 4 - дидезметилпармидин; 5 - пармидин.

В табл. 2 представлены данные по влиянию состава осадителя (0,1 N серная кислота - этанол) на определение пармидина. Видно, что смесь данных компонентов в соотношении (10-50): (50-90) обеспечивает наилучшие метрологические характеристики определения препарата.

Количественное определение пармидина проводили по предварительно построенному калибровочному графику зависимости сигнала детектора (высоты хроматографического пика) от концентрации анализируемого вещества. Определение проводили в максимуме поглощения пармидина - 264 нм. Предел обнаружения препарата при соотношении сигнал/шум-2 составляет 0,5 мкг, диапазон определяемых содержаний 1-20 мкг/мл пармидина в биологической пробе. В табл. 3 представлены результаты определения пармидина в слюне. Видно, что данный способ характеризуется высокой воспроизводимостью (S_r = 0,04) и правильностью результатов анализа.

Сравнительная характеристика данных (табл. 3) с результатами определения по способу прототипа доказывает лучшую воспроизводимость и правильность результатов предлагаемого способа. Так, в частности, степень извлечения пармидина составляет всего 73% у прототипа и 99% у предлагаемого способа.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Изучение фармакокинетики пармидина путем определения его содержания в слюне после однократного приема препарата 10 мг/кг.

Пробу слюны (1-2 мл) собирают через 2, 4, 6, 8, 12, 24 ч после начала исследования и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. К 200 мкл супернатанта добавляют 200 мкл смеси 0,1N серной кислоты и этанола (30: 70) и встряхивают на вибраторе в течение 1 мин, после чего пробу центрифугируют (7000 об/мин в течение 20 мин) и 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф. Условия хроматографирования: хроматограф "Милихром", колонка 64х2 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом "Силасорб-С₁₈", подвижная фаза ацетонитрил-вода (20: 80, об. % ), расход 100 мкл/мин. Длина волны детектора - 264 нм. Количественное определение проводили по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата. Содержание пармидина в слюне в указанные промежутки времени составляет соответственно 13,3; 12,4; 6,6; 5,5; 3,8; 1,9 мкг/мл.

П р и м е р 2. Изучение фармакокинетики пармидина путем определения его содержания в плазме крови после однократного приема 10 мг/кг (табл. 4).

Пробу плазмы крови, отобранной через 2, 4, 6, 8, 12, 24 ч после начала исследования, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. К 200 мкл супернатанта добавляют 400 мкл смеси осадителя и далее поступают аналогично примеру 1. Содержание пармидина в плазме крови в указанные промежутки времени составляет соответственно 14,0; 13,1; 7,1; 5,9; 4,2; 2,2 мкг/мл.

Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность определения пармидина в биологических жидкостях за счет предварительного осаждения белковых компонентов биопробы смесью этанол - серная кислота; добиться упрощения способа из-за снижения трудоемкости подготовки биопробы к ВЭЖХ анализу, а также использования отечественного оборудования. (56) Бергфилд Э. и др. Газовая хроматография в биохимии. М. : Мир, 1965, гл. III.