способ хранения микроорганизмов

Формула изобретения

СПОСОБ ХРАНЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ путем внесения суспензии микроорганизмов в физиологический раствор, отличающийся тем, что в физиологический раствор предварительно вводят волокна капрона, или полипропилена, или лавсана, или вискозы в количестве 15 - 25 г/л, а суспензию микроорганизмов вносят с концентрацией 0,5 10⁶ - 7,5 10⁶ кл/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в том числе и к технической, и касается сред (способов), применяемых для хранения коллекций микроорганизмов.

Известно, что жизнеспособность микроорганизмов поддерживается следующими методами: периодическими пересевами в условиях низких и ультранизких температур, лиофилизацией под минеральным маслом, путем высушивания с использованием различных питательных сред.

Известно, что при периодических пересевах (главным образом аспорогенных) используют свежие питательные среды и пересевы проводят один-два раза в месяц (иногда еженедельно). Однако частые пересевы могут снижать активность продуцентов биологически важных веществ. Кроме того, недостатками метода считаются возможность заражения, краткосрочность хранения, а также трудоемкость работы и расход в больших количествах реактивов, входящих в состав питательных сред [1] .

Известно хранение микроорганизмов в условиях низких и ультранизких температур, для подготовки клеток их суспензируют в среде, содержащей криопротекторы. В качестве криопротекторов применяют либо 20% -ное снятое молоко, либо 24% -ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом ростовой среды, либо 10% -ный декстран, либо лошадиную сыворотку, инозит, 10-20% -ный глицерин, 7-10% -ный диметилсульфоксид и, например, 10% -ный поливинилпирролидон [2] . Недостатком такого хранения микроорганизмов является необходимость специального оборудования, необходимы меры предосторожности при проверке герметичности стеклянных ампул для предупреждения взрыва. Кроме того, при высоких скоростях охлаждения образуются внутриклеточные кристаллы льда, вызывающие повреждения и гибель клеток. При быстром охлаждении в мембранах образуются гидрофильные каналы, через которые происходит утечка из клеток веществ. При медленном охлаждении липидные цепочки перестраиваются и препятствуют образованию таких каналов. Оптимальной скоростью считается та, при которой клетки подвергаются наименьшим повреждениям.

Известны факты изменения структуры и физико-химических свойств микроорганизмов в результате замораживания-высушивания. Наблюдается уменьшение размеров лиофилизированных клеток, например, Saclhoromyces cerecisiae, и E. coli после реактивации. У отдельных штаммов микроорганизмов происходят задержка скорости роста и пигментообразования, снижение антибиотической и бродильной активностей или даже потеря отдельных признаков [2] .

Известно хранение микроорганизмов на питательных средах под слоем вазелинового масла. Для этого культуру микроорганизмов выращивают на благоприятной питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла 0,5-1,0 см) замедляет скорость обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Но иногда хранение под маслом вызывает задержку роста микробов (1,5-2 раза по сравнению с периодическими пересевами культур) и снижает скорость использования ими питательных субстратов. У некоторых мицелиальных грибов после хранения под маслом обнаружены признаки утраты спороношения, уменьшения скорости роста, образование секторных колоний. Кроме того, к недостаткам хранения на питательных средах под слоем вазелинового масла следует отнести возможность инфицирования лаборатории и работающего персонала из-за разбрызгивания масла при обжигании петли [1, 2] .

Известно, что выращивание микроорганизмов на специальных питательных средах с получением суспензии не менее 10⁸ клеток/мл, с последующим воздушным высушиванием на различных адсорбентах способствует хранению спорообразующих бактерий.

Спорообразующие бактерии хранят на стерильной почве, песке, силикагеле, пшене, фильтровальной бумаге, вате, стеклянных и фарфоровых бусах. Однако бактерии лучше выживают при высушивании не на воздухе, а под вакуумом [2, 3] .

Наиболее близким техническим решением к изобретению является выращивание микроорганизмов на специальных средах до достижения суспензии 10⁸-10¹⁰ клеток/мл с последующим высушиванием.

Недостатком прототипа является то, что возможно хранение преимущественно спорообразующих микроорганизмов, кроме того, для создания среды хранения требуется дополнительная стадия - высушивание на воздухе или (предпочтительнее) под вакуумом [2] .

Целью изобретения является сохранение жизнеспособности и удлинение сроков выживания микроорганизмов.

Это достигается тем, что в среду, включающую физиологический раствор, дополнительно вводят волокно капрон или полипропилен, или вискозное, или лавсан при следующем соотношении компонентов, г/л: Волокно 15-25

Физиологический раствор, л До 1

В работе использовали следующие тест-культуры: St. aureus 209, E. coli 670, Ps. aeruginosa 150, C. albicans 2, Bac. subtilis 67.

Культуры выращивали на плотной питательной среде мясопептонном агаре (МПА), затем готовили взвеси из суточных культур до концентрации 10⁶ клеток/мл: St. aureus 209 2 10⁶ кл/мл, E. coli 670 7 10⁶ кл/мл, Ps. aeruginosa 150 7,5 10⁶ кл/мл, C. albicans 2 0,5 10⁶ кл/мл, Bac. subtilis 67 0,5 10⁶ кл/мл.

Исследовались волокна: капрон, полипропилен. вискозоне, лавсан, ацеталированные глутаровым альдегидом (ПВС-ГА). Волокна отмывали от замасливателя дистиллированной водой, четыреххлористым углеродом, этиловым спиртом и экстрагировали в этиловом спирте.

Среду для хранения микроорганизмов готовили следующим образом: нужное количество волокна помещали в одноразовые пробирки, емкостью 1,0 мл и подвергали -стерилизации на Ленинградском заводе медицинских полимеров. Доза 2,5 Град. Затем в пробирки, содержащие стерильные волокна, в асептических условиях вносили по 0,1 мл взвеси соответствующей тест-культуры на физиологическом растворе.

Пробирки хранили вертикально при температуре 20 2^оС. Через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения определяли выживаемость и жизнеспособность исследуемых культур.

Для определения сохранности живых культур различными методами общепринято использовать в качестве критерия подсчет их колоний, выросших после предварительного культивирования на богатых питательных средах, или только констатировать факт роста на соответствующей жидкой или плотной среде. Процент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100% .

Выживаемость культур определяли следующим образом: содержимое пробирки помещали в 1 мл физиологического раствора, встряхивали и живую фазу в количестве 0,1 мл высевали на плотную питательную среду, через 18-20 ч культивирования при 37^оС проводили учет выросших колоний микроорганизмов.

Способность к размножению определяли следующим образом: содержимое пробирки переносили в 1 мл питательной среды и культивировали при 37^оС в течение 18-20 ч. Затем проводили количественное определение выросших микроорганизмов путем высева на плотную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний. Способность к размножению определяли после предварительных разведений на богатых питательных средах (МПБ) констатированием роста при наибольшем разведении, где отмечен визуально рост с последующим подсчетом количества выросших колоний.

Полученные экспериментальные данные приведены в табл. 1-6.

Как видно, из данных приведенных в табл. 1 и 2, использование питательной среды, содержащей физиологический раствор и волокно капрон, приводит к увеличению жизнеспособности St. aureus шт. 209 до 12 месяцев хранения, при этом выживаемость увеличивается на 50-80% по сравнению с прототипом. Следует отметить, что среда, содержащая физиологический раствор и волокно капрон в количестве 15-25 г/л, обеспечивает наилучшее хранение St. aureus шт. 209 до 12 месяцев. При содержании волокна 10 г/л, т. е. меньше меньшего, наблюдается уменьшение жизнеспособности культуры и выживаемости ее, но указанные показатели выше прототипа. При содержании волокна капрон 30 г/л, т. е. больше большего, не наблюдается увеличения жизнеспособности и выживаемости культуры. Аналогичные результаты были получены и при хранении в данной среде E. coli шт. 670, Ps. aeruginosa шт. 150, C. albicaus шт. 2, Bac. subtilis 67. Среда данного состава обеспечивает жизнеспособность и выживаемость как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе дрожжеподобных грибов рода кандида, спорообразующие аэробы также хорошо переносят хранение до 12 месяцев, при этом выживаемость составляет 91-96% , а в среде прототипе хранение до 9 месяцев идет с потерей жизнеспособности, рост культуры при этом отмечен только до 10^-4-10^-5разведения, выживаемость при этом составляет 47-35% .

В табл. 3 приведены данные по хранению микроорганизмов в питательной среде, содержащей полипропилен в физиологическом растворе.

Из приведенных данных видно, что питательная среда, содержащая полипропилен и физиологический раствор, обеспечивает хранение исследуемых микроорганизмов до 12 месяцев, при этом жизнеспособность и выживаемость культур выше прототипа, так, например, при хранении St. aureus жизнеспособность на сохраняется до 12 месяцев, при этом рост отмечен до 10^-6 разведения, а выживаемость выше на 60-85% по сравнению с прототипом. Аналогичные результаты получены при хранении грамотрицательных бактерий: E. coli, Ps aeruginosa, а также дрожжеподобных грибов рода кандида и спорообразующих аэробов. Жизнеспособность исследуемых культур сохраняется до 12 месяцев, выживаемость при этом соответственно составляет 75-90% , что значительно выше среды прототипа.

Наилучшие результаты получены при содержании в среде 20 г/л волокна полипропилен. При содержании полипропилена 10 г/л, т. е. меньше меньшего, наблюдается снижение жизнеспособности до 6-9 месяцев, при этом рост отмечен только до разведений 10^-4-10^-5, выживаемость составляет 77-83% . При содержании в среде волокна полипропилен 30 г/л (больше большего) не отмечено увеличения жизнеспособности и выживаемости исследуемых тест-культур. Оптимальным является питательная среда, содержащая 15-25 г/л волокна полипропилен.

Питательная среда, содержащая волокно лавсан и физиологический раствор, оказалась пригодной для хранения грамотрицательных микроорганизмов, дрожжеподобных грибов рода кандида и спорообразующих анаэробов. При хранении в данной питательной среде St. aureus жизнеспособность сохраняется только в течении 13 месяцев, при этом жизнеспособность, т. е. рост отмечается только до разведения 10^-3, а выживаемость составляет 30% , через 3 месяца хранения не отмечено роста культуры как при минимальном, так и при максимальном содержании компонентов питательной среды.

Среда предлагаемого состава оказалась пригодной для хранения грамотрицательных бактерий E. coli, Ps. aeruginosa. Жизнеспособность исследуемых культур сохраняется до 12 месяцев, выживаемость при этом составляет 80-90, что на 50-70 раз больше среды прототипа. При хранении дрожжеподобных грибов рода кандида жизнеспособность также сохраняется до 12 месяцев, при этом рост культуры отмечен при максимальном разведении до 10^-6, выживаемось составляет 80-90% . Среда, содержащая волокно лавсан и физиологический раствор, пригодна для хранения спорообразующих аэробных бактерий. Например, Bac. subtilis хранится до 12 месяцев, при этом рост культуры отмечен при максимальном разведении до 10^-6, жизнеспособность при этом составляет 90-98% . Результаты исследования приведены в табл. 4.

Среда для хранения микроорганизмов, содержащая физиологический раствор и волокно вискозу, оказалась пригодной для хранения только грамположительных микроорганизмов, например St. aureus дрожжеподобных грибов рода кандида, а также спорообразующих анаэробных бактерий Bac. subtilis. Грамотрицательные бактерии E. coli и Ps. aeruginosa в среде данного состава не могут хранится. Результаты исследования приведены в табл. 5.

Как видно из данных, представленных в табл. 5, среда предлагаемого состава пригодна для хранения грамположительных микроорганизмов, при этом выживаемость St. aureus на 50-80% выше, чем в среде-прототипе, а при определении жизнеспособности рост обнаружен при разведении до 10^-6 от 1-го до 12-ти месяцев хранения. Аналогичные результаты были получены при использовании разработанной среды предлагаемого состава для хранения дрожжеподобных грибов рода кандида и спорообразующих аэробных микроорганизмов (выживаемость составляет в среднем 80-100% ).

Разработана среда для хранения бактерий, содержащая физиологический раствор и волокно поливинилспиртовое, ацеталированное глутаровым альдегидом. Были приготовлены среды, имеющие минимальный, оптимальный и максимальный состав ингредиентов. Результаты исследования приведены в табл. 6. Среда предлагаемого состава пригодна для хранения грамотрицательных микроорганизмов, а также спорообразующих аэробов и дрожжеподобных грибов рода кандида. Грамположительные, например, St. aureus могут храниться в разработанной среде только в течение 1-3 месяцев, при этом выживаемость составляет только 30% , рост наблюдается в разведении до 10^-3. Грамотрицательные E. coli и Ps. aeruginosa бактерии, дрожжеподобные грибы C. albicaus и спорообразующие аэробы в предлагаемой среде хранятся до 12 месяцев, выживаемость составляет 80-96% , визуальный рост исследуемых культур отмечен в разведении до 10^-6. В табл. 6 приведены результаты исследования. По сравнению со средой-прототипом выжива- емость на 55-100% в разработанной среде. Следует подчеркнуть, что в предлагаемых средах полностью исключена стадия, имеющая место при использовании прототипа, т. е. высушивание.

Из данных, приведенных в табл. 6 видно, что при использовании среды предлагаемого состава при минимальном содержании ингредиентов 15 г/л (волокно ПВС-ГА на 1 л физ. раствора) для хранения St. aureus сохраняется в течение 1 месяца, выживаемость составляет 30% , что примерно соответствует выживаемости в среде прототипе. При содержании компонентов среды меньше меньшего, 10 мг/л, не отмечено сохранения культуры в среде. При оптимальном содержании волокна в среде 20 г/л отмечено увеличение хранения St. aureus до 3-х месяцев, выживаемость составляет 33-23% , а при содержании ингредиентов больше большего, т. е. 30 г/л, не отмечено увеличения хранения культуры. При использовании среды предлагаемого состава для хранения грамотрицательных микроорганизмов E. coli и Ps. aeruginosa отмечено, что при использовании среды минимального состава выживаемость составляет 70-80% , что на 30-45% выше, чем в среде-прототипе, рост культур при этом отмечен при максимальном разведении до 10^-6. При использовании разработанной среды оптимального состава (20 г/л) отмечено увеличение выживаемости до 85-100% , что на 55-100% выше среды прототипа. Аналогичные результаты получены при использовании среды максимального компонентного состава (табл. 6), при использовании разработанной среды, содержащей ингредиенты большего (30 г/л), не отмечено дальнейшего увеличения выживаемости исследуемых тест-культур. При использовании среды предлагаемого состава для хранения дрожжеподобных грибов рода кандида и спорообразующих аэробов выживаемость составляет 88-100% до 12 месяцев хранения. Визуальный рост отмечен при максимальном разведении до 10^-6. Оптимальной является среда содержащая 20 г/л волокна. При содержании ингредиентов меньше меньшего (10 г/л) выживаемость ниже, а при компонентном составе больше большего (30 г/л) не наблюдается увеличения выживаемости культур. Полученные экспериментальные данные, приведенные в табл. 1-6, свидетельствуют о том, что жизнеспособность и выживаемость микроорганизмов зависит от вида бактерий и состава предлагаемых сред.

В результате исследований выявлено, что наилучшими средами для хранения бактерий являются среды, содержащие гидрофобные волокна, например капрон, полипропилен, лавсан. Среды, содержащие указанные ненабухаемые волокна (в воде), способствуют выживаемости и обеспечивают жизнеспособность всех исследуемых культур - грамотрицательных, грамположительных, дрожжеподобных грибов рода кандида, спорообразующих аэробных бактерий, причем выживаемость составляет 85-100% , а жизнеспособность сохраняется до двенадцати месяцев, рост культур в этих случаях отмечен при максимальном разведении до 10^-6. Вискозное волокно, входящее в состав среды, пригодно для хранения грамположительных, дрожжеподобных грибов и спорообразующих аэробов. Среда, содержащая физиологический раствор и поливинилспиртовое волокно, ацеталированное глутаровым альдегидом, может быть использована для хранения грамотрицательных, спорообразующих аэробных бактерий, а также дрожжеподобных грибов рода кандида. (56) 1. Промышленная микробиология. /Под ред. Н. С. Егорова. М. , 1989, с. 149-167.

2. Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф Герхардта. М. , 1983, т. 1б с. 535.

3. Сидякина Т. М. Консервация микроорганизмов, Пущино, 1985.