средство, обладающее противоишемической активностью в экспериментальной кардиологии

Формула изобретения

Применение водного экстракта сине-зеленой микроводоросли Spirulina platensis (Nordst) в качестве средства, обладающего противоишемической активностью в экспериментальной кардиологии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиологии, и может быть использовано в качестве средства, обладающего противоишемической активностью.

Известны средства, которые применяются в качестве протекторов миокарда от ишемических повреждений: верапамила (Lange et al. "Effects of recurrent iscemia an myocardial high energy phosphate in content in canine herts". Basic Res. Cardiol. 1984. V. 79 P. 469-478. ) фосфокреатина (Robinson L. A. et al. "Creatine phosphate. An additive myocardial protective and antiarrythmic agent in cardioplegia". J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1984. V. 87. P. 190-200).

Однако эти средства недостаточно эффективны: верапамил снижает сократительную активность и угнетает насосную функцию миокарда, а фосфокреатин в незначительной степени устраняет реперфузионный кальциевый парадокс и является дорогостоящим препаратом.

Целью изобретения является повышение протекции миокарда, находящегося в условиях тотальной ишемии, выражающееся в уменьшении степени контрактуры, скорости контрактурного давления, улучшении сократительной способности и процессов расслабления сердечной мышцы при реперфузии, а также улучшении его энергообеспечения.

Поставленная цель достигается введением в перфузат изолированного сердца водного экстракта биомассы сине-зеленой микроводоросли Spirulina platensis (Nordst. ) CALU - 835 (А. С. СССР N 1347204).

Изучение патентной и научно-технической документации не позволило установить использование биомассы спирулины в качестве кардиотропного средства, обладающего противоишемической активностью, что соответствует критериям "новизна" и "существенные отличия".

Водный экстракт биомассы спирулины (ВЭБС) получают культивированием указанного штамма на минеральной питательной среде следующего состава, мл: NaNO₃ 2,5; NaHCO₃ 16,0; Na₂HPO₄ 0,2; NaCl 1,0; MgSO₄ x 7H₂O 0,2; K₂SO₄ 1,0; H₃BO₃ 0,005; Kl 0,0005; CaCl₂ 0,04 г/л; FeEDTA 1,0; раствор микроэлементов N 1 - 10,0 мл/л NaEDTA - 0,885; MnSO₄ x 7H₂O - 0,310; MoO₃ - 0,046; ZnSO₄ x 7H₂O - 0,044; CuSO₄ x 5H₂O - 0,010 (г/л); раствор микроэлементов N 2 - 1,0 мл/л NH₄VO₃ - 0,023; K₂Cr₂(SO₄) x 24H₂O - 0,096; NiSO₄ x 7H₂O - 0,048; Na₂WO₄ x 2H₂O - 0,18; Ti(SO₄)₃ - 0,04; Co(NO₃)₂ x 6H₂O - 0,04 (г/л); при постоянном освещении 9-15 тыс. эрг/см² с, периодическом перемешивании и температуре 352^оС. При достижении плотности 1,5-1,6 г/л сухого вещества, обычно на 5 сутки, биомассу отделяют фильтрованием, промывают физиологическим раствором и ресуспендируют в дистиллированной воде из расчета получения суспензии плотности 1,0 г/л сухого вещества. Далее полученную концентрированную суспензию спирулины обрабатывают ультразвуком 22 кГц в течение 30 с пятикратно с интервалом 60 с, который обеспечивает полную дезинтеграцию клеток спирулины. Разрушенную ультразвуком биомассу центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 10000 g в течение 20 мин. Полученный супернатант, представляющий собой прозрачную жидкость, декатируют, разливают по флаконам, хранят при температуре - 20^оС в течение 6 месяцев (срок наблюдения) и используют по мере необходимости.

Применение ВЭБС оказывает противоишемическое действие, уменьшая степень контрактуры, увеличивая время его наступления, восстанавливая сократительную способность и процессы расслабления сердечной мышцы при реперфузии, а также ее энергообеспечение.

Исследование действия ВЭБС проводят на изолированных сердцах крысах-самцах линии Вистар массой 200-230 г, которым в течение 6 месяцев вводили раствор медного купороса в дозе 10 мг/кг массы тела с целью развития токсического поражения миокарда (ТПМ) (М. И. Попович "Токсическое и аутоиммунное поражение миокарда" Автореф. дис. докт. , М. 1987). Одновременно исследуют сердца контрольных интактных животных. Животному под уретановым наркозом вскрывают грудную клетку, извлекают сердце и перфузируют его ретроградно через аорту по методу Лангендорфа раствором Кребса при Т-37^оС, рН - 7,4 и скорости перфузата 10 мл/мин на 1 г ткани. В полость левого желудочка помещают латексный баллончик с давлением 11-13 мм рт. ст. , сжимая который желудочек осуществляет изоволюмические сокращения. Баллончик соединяют с тензометрическим датчиком Could Statham P 23 b аппарата Lineacorder MARK WR 3101 и определяют систолическое давление, диастолическое давление, амплитуду ишемической контрактуры. Электростимулятором ЭСЛ-2 навязывают ритм 4 Гц. До остановки аортального протока сердца контрольных животных перфузируют 20 мин раствором Кребса, а сердца животных с ТПМ pаспpеделяют на две группы: одну группу перфузируют раствором Кребса в течение 20 мин, другую 10 мин раствором Кребса, а затем еще 10 мин раствором Кребса, содержащий ВЭБС в концентрации от 2,4 до 3,2 мл/л. Тотальную ишемию создают полным пережатием аортального протока на протяжении 30 мин, после чего каждое сердце реперфузируют в течение 20 мин раствором Кребса. Физиологические параметры регистрируют перед ишемией, во время ишемии и реперфузии. Затем сердца с ТПМ, перфузируемые до ишемии раствором Кребса, сердца с ТПМ перфузируемые до ишемии раствором Кребса, содержащий 2,8 мл/л ВЭБС, а также сердца контрольных животных замораживают в жидком азоте и определяют в них содержание аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), аденозинмонофосфорной кислоты (АМФ), креатинфосфата (КрФ), креатина (Кр) и тотального креатина (Тот. Кр).

П р и м е р 1. Исследование действия ВЭБС проводят на изолированных сердцах крысах-самцах линии Вистар массой 200-230 г, которым в течение 6 месяцев вводили раствор медного купороса в дозе 10 мг/кг массы тела с целью развития токсического поражения миокарда (ТПМ). Одновременно исследуют сердца контрольных интактных животных. Животному под уретановым наркозом вскрывают грудную клетку, извлекают сердце и перфузируют его ретроградно через аорту по методу Лангендорфа раствором Кребса при 37^оС, рН 7,4 и скорости перфузата 10 мл/мин на 1 г ткани. В полость левого желудочка помещают латексный баллончик с давлением 11-13 мм рт. ст. , сжимая который желудочек осуществляет изоволюмические сокращения. Баллончик соединяют с тензометрическим датчиком Gould Statham P 23 b аппарата Lineacorder MARK WR 3101 и определяют систолическое давление, диастолическое давление, амплитуду ишемической контрактуры. Электростимулятором ЭСЛ-2 навязывают ритм 4 Гц. До остановки аортального протока сердца контрольных животных перфузируют 20 мин раствором Кребса, а сердца животных с ТПМ разделяют на две группы: одну группу перфузируют раствором Кребса в течение 20 мин, другую 10 мин раствором Кребса, а затем еще 10 мин раствором Кребса, содержащим ВЭБС в концентрации 2,4 мл/л. Тотальную ишемию создают полным пережатием аортального протока на протяжении 30 мин, после чего каждое сердце реперфузируют в течение 20 мин раствором Кребса. Физиологические параметры регистрируют перед ишемией, во время ишемии и реперфузии.

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Из таблицы видно, что в сердцах с ТПМ, которые перфузировались до ишемии раствором Кребса без ВЭБС, развиваются выраженные отклонения от контрольных величин всех физиологических показателей (исключение составляет диастолическое давление перед ишемией, которое устанавливают одинаковым во всех сериях и равняется давление жидкости в латексном баллончике).

Данные таблицы свидетельствуют о том, что ВЭБС в дозе 2,4 мл/л обладает выраженным противоишемическим действием. Это проявляется, во-первых, достоверным удлинением времени начала контрактуры на 63% по сравнению с серией животных с ТПМ, сердца которых перфузировались раствором Кребса без ВЭБС, хотя оно и не достигло уровня контроля. Во-вторых, в сердцах с ТПМ, перфузируемых ВЭБС, степень контрактуры была значительно ниже. Если контрактурное давление сердец с ТПМ на 30 мин ишемии возрастает до 614,6 мм рт. ст. , то наличие в перфузате 2,4 мл/л ВЭБС достоверно уменьшает его на 35% . В то же время этот показатель продолжает оставаться выше уровня контроля (p< 0,05).

При изучении восстановления сердечной функции в период реперфузии выявлено, что введение до ишемии в перфузат 2,4 мл/л ВЭБС положительно влияет на показатели восстановления сердечной функции. Отмечено достоверное повышение под влиянием ВЭБС систолического давления (р< 0,01). Что касается диастолического давления - показателя, характеризующего степень расщепления актомиозиновых связей и выход миокарда из контрактуры, - то оно на 20 мин реперфузии, наоборот, достоверно снизилось по сравнению с серией животных с ТПМ, сердца которых перфузировались раствором Кребса без ВЭБС. Однако полного восстановления сердечной функции до уровня контроля под влиянием 2,4 мл/л ВЭБС не отмечено.

Таким образом, перфузия сердец с ТПМ 2,4 мл/л ВЭБС существенно защищает миокард от ишемических повреждений, что выражается в удлинении времени наступления контактурных изменений, в уменьшении амплитуды контрактурного давления, а также в более полном восстановлении сократительной функции и процессов расслабления сердечной мышцы при реперфузии.

П р и м е р 2. Схема опыта аналогична примеру 1, с той разницей, что сердца с ТПМ перфузировались до ишемии раствором Кребса, содержащим 2,8 мл/л ВЭБС.

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Из таблицы видно, что в сердцах с ТПМ, которые перфузировались до ишемии раствором Кребса без ВЭБС, развиваются выраженные отклонения от контрольных величин всех физиологических показателей (исключение составляет диастолическое давление перед ишемией, которое устанавливается одинаково во всех сериях, и равняется давлению жидкости в латексном баллончике).

Данные таблицы свидетельствуют далее, что ВЭБС в дозе 2,8 мл/л оказывает более выраженное противоишемическое действие по сравнению с дозой 2,4 мл/л. Это проявляется удлинением времени начала контрактуры более чем в 2 раза по сравнению с сердцами с ТПМ, которые перфузировались до ишемии раствором Кребса без ВЭБС; при этом время начала контрактуры практически не отличалось от такового у сердец контрольной группы.

Контрактурное давление в сердцах с ТПМ, перфузируемых ВЭБС в дозе 2,8 мл/л, наоборот, снизилось в два раза и достигло уровня такового в контрольной серии животных.

Введение в перфузат ВЭБС в дозе 2,8 мл/л способствует полному восстановлению сердечной функции. Систолическое давление на 20 мин реперфузии достигло исходного уровня перед ишемией. Что касается диастолического давления, то оно также восстановилось полностью к 20 мин реперфузии.

Таким образом, перфузия ТПМ сердец ВЭБС в дозе 2,8 мл/л в высокой степени обеспечивает защиту миокарда от ишемии, что выражается в удлинении времени наступления контактурных изменений, уменьшении амплитуды контрактурного давления, а также в полном восстановлении сократительной функции и процессов расслабления сердечной мышцы при реперфузии.

П р и м е р 3. Схема опыта как в примере 1, с той разницей, что сердца животных с ТПМ перфузировались до ишемии раствором Кребса, содержащим 3,2 мл/л ВЭБС.

Полученные результаты приведены в табл. 1. Из таблицы видно, что в сердцах с ТПМ, которые перфузировались до ишемии раствором Кребса без ВЭБС, развиваются выраженные отклонения от контрольных величин всех физиологических показателей (исключение составляет диастолическое давление перед ишемией, которое устанавливают одинаково во всех сериях и равняется давлению жидкости в латексном баллончике).

Данные таблицы свидетельствуют далее, что ВЭБС в дозе 3,2 мл/л обладает высоким противоишемическим действием, однако полученный эффект был менее выраженным по сравнению с таковым полученным при перфузии сердец с ТПМ раствором Кребса, содержащим ВЭБС в дозе 2,8 мл/л.

При этом как и при дозе 2,4 мл/л ВЭБС время начала контpактуpы достоверно увеличилось на 60% , а амплитуда контрактурного давления уменьшилась на 27% по сравнению с сердцами с ТПМ, которые перфузировались до ишемии раствором Кребса без ВЭБС.

ВЭБС в дозе 3,2 мл/л положительно влияет на показатели восстановления сердечной функции. Отмечено восстановление систолического давления на 20 мин реперфузии на 84% и снижение диастолического давления на 20 мин реперфузии на 33% по сравнению с таковым в сердцах с ТПМ до реперфузии.

Таким образом, перфузия сердец с ТПМ раствором ВЭБС в дозе 3,2 мл/л существенно защищает миокард от ишемических повреждений, что выражается в удлинении времени наступления контрактурных изменений, уменьшении амплитуды контрактурного давления, а также в более полном восстановлении сократительной функции и процессов расслабления сердечной мышцы при реперфузии. При этом полученный положительный эффект был менее выраженным по сравнению с таковым, полученным при реперфузии сердец 2,8 мл/л ВЭБС. Дозу 2,8 мл/л ВЭБС следует считать оптимальной для проявления противоишемического эффекта. При испытании ВЭБС в дозах ниже 2,4 мл/л и выше 3,2 мл/л отмечается отсутствие положительного противоишемического эффекта.

П р и м е р 4. Схема опыта как в примере 1, с той разницей, что сердца с ТПМ до ишемии перфузируют раствором Кребса, содержащим 2,8 мл/л ВЭБС, а на 20 мин реперфузии сердца быстро замораживают в жидком азоте и в них определяют содержание адениннуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ), креатинфосфата (КрФ), креатина (Кр) и тотального креатина (Тот. Кр). Эти же показатели определяют в сердцах контрольных животных и в сердцах с ТПМ, перфузируемых до ишемии раствором Кребса без ВЭБС. В каждой серии были использованы сердца 8 животных (всего 24).

Полученные результаты представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что к 20 мин реперфузии энергообеспечение сократительной функции сердец с ТПМ, перфузируемых до ишемии раствором Кребса, содержащим 2,8 мл/л ВЭБС, находится на более высоком уровне, чем в сердцах с ТПМ, перфузируемых раствором Кребса без ВЭБС, и не отличается от такового в сердцах контрольных животных.

Содержание АТФ, АДФ на 20 мин реперфузии было на 42% и 34% , а КрФ, Кр и Тот. Кр. в 1,6; 4,4 и 1,5 раза соответственно выше, чем в сердцах с ТПМ, перфузируемых раствором Кребса без ВЭБС.

Дефицит макроэргических фосфатов представляет собой важное звено в патогенезе ишемических повреждений миокарда. Так как для расслабления сердечной мышцы требуется АТФ, то выраженное снижение его уровня при ишемии приводит к развитию контрактуры вследствие невозможности диссоциации актомиозиновых мостиков. Недостаточное содержание АТФ в миокарде при реперфузии является главной причиной неполного восстановления систолического и диастолического давления сердец с ТПМ, перфузируемых до ишемии раствором Кребса без ВЭБС.

Одной из важных причин противоишемического эффекта ВЭБС, по-видимому, является его способность дольше поддержать необходимый уровень фосфатных макроэргов в локальных пулах миофибрилл, а также предупреждать повреждения сарколеммы, приводящие к потерям креатина кардиомиоцитами.

Таким образом, ВЭБС обладает выраженным противоишемическим действием, характеризующимся удлинением начала контрактуры, уменьшением степени и скорости нарастания контрактурного давления, улучшением сократительной способности и процессов расслабления сердечной мышцы при реперфузии, а также улучшением его энергообеспечения.

Применение предлагаемого средства обеспечивает более выраженный противоишемический эффект по сравнению с известными средствами и позволяет расширить ассортимент противоишемических средств. (56) 1. Авторское свидетельство N 1347204, кл. А 01 Н 13/00, 1991.

2. Robinson etal L. A. - J. Thorac. Cardiovasc. S. , 1984, v. 87, p. 190-200.